Small RNA是一种小的非编码RNA，长度为18-30个核苷酸，几乎存在于所有的生物体中，包括：miRNA、siRNA和piRNA。Small RNA通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除，来调控生物体的生长发育和疾病发生，在人、动植物的转录和转录后调控过程中起着重要的作用。

Small RNA高通量测序分析目前被广泛应用于动植物生长、分化、发育和凋亡等发育调控研究；药物、胁迫等环境适应性研究；病毒、真菌、细菌等免疫互作研究等方面。

小RNA测序分析平台可以进行标准分析和个性化分析，其中标准分析包括：miRNA的鉴定与预测；miRNA表达量分析；miRNA靶基因预测；miRNA靶基因注释分类及富集等。设定参数后点击提交进行分析，分析完成后在基本分析页面下生成标准化结题报告，实现一键式生成。

sRNA基本分析以新一代高通量转录组测序（RNA-Seq）数据作为输入，测序得到的原始序列含有接头序列或低质量序列，为了保证信息分析的准确性，需要对原始数据进行质量控制，得到高质量序列（即Clean Reads），原始序列质量控制的标准为：

1.去除低质量Reads（质量值低于30的碱基所占比例超过20%）；

2.去除未知碱基N含量大于等于10%的Reads；

3.截除3’端接头和Barcode序列；

4.去除短于18或长于30个核苷酸的序列。

对于得到的Clean Reads，利用Bowtie[1]软件，将其分别与Silva数据库、GtRNAdb数据库、Rfam数据库和Repbase数据库进行序列比对，过滤核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）、核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）等ncRNA以及重复序列，获得包含miRNA的Unannotated reads。

利用miRDeep2软件[2]将Unannotated reads与参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组上的位置信息，即为Mapped Reads。

针对miRNA的生物特征，对于比对到参考基因组的序列，利用miRDeep2软件进行已知及新的miRNA鉴定。miRDeep2软件将18 30nt的核苷酸序列比对到miRBase数据库中特定物种上，鉴定该物种已知的miRNA；过滤获得的未比对到参考基因组，通过碱基数目延伸，进行miRNA结构预测，获得新的miRNA。

miRNA的鉴定和预测完成后，接下来是对各样本中miRNA进行表达量的统计，并用TPM算法[3]对表达量进行归一化处理。TPM归一化处理公式为：

公式中，readcount表示比对到某一miRNA的reads数目；Mapped Reads表示比对到参考基因组上的reads数目。

利用TPM算法对表达量进行归一化处理后，能够消除不同样品间测序量差异的影响，科学、准确的比较各样品间miRNA的差异表达情况。

检测差异表达miRNA时，需要根据实际情况选取合适的差异表达分析软件。DESeq[4]适用于有生物学重复的实验，可以进行样品组间的差异表达分析，获得两个生物学条件之间的差异表达miRNA集；对于没有生物学重复的实验，则使用IDEG6[5]进行差异表达分析，获得两个样品之间的差异表达miRNA。

在差异表达miRNA检测过程中，使用差异倍数（Fold Change，FC）和错误发现率（False Discovery Rate，FDR）作为筛选标准。FC表示两样品（组）间表达量的比值。由于miRNA的差异表达分析是对大量的miRNA表达量进行独立的统计假设检验，会存在假阳性问题，因此在分析过程中，采用了公认的Benjamini Hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性p值（p value）进行校正，并最终采用FDR作为差异表达miRNA筛选的关键指标。

根据已知miRNA和新预测的miRNA与对应物种的基因序列信息，对于植物物种，我们使用TargetFinder软件[6]进行靶基因预测；对于动物物种，用miRanda[7]和RNAhybrid软件[8]进行靶基因预测，对两个软件的预测结果取交集。

靶基因预测完成后，我们会使用BLAST软件将预测到的靶基因与NR[9]、Swiss Prot[10]、GO[11]、COG[12]、KEGG[13]、KOG[14]、Pfam[15]数据库比对，获得靶基因的注释信息。

小RNA在疫霉菌感染大豆中的防御机制解析

本研究对大豆抗病材料 Williams82 和感病材料Harosoy接种大豆疫霉菌，未接种和接种后 8 小时根部进行小 RNA测序，每个样品测序数据量 10-13M。共鉴定到已知miRNA 324 个，属于 109 个miRNA家族。预测到新miRNA 54个，与已有大豆降解组数据比较发现 36 个miRNA具有较高可信度。miR-1507 和 miR-2109 调控 NB-LRR 基因的表达；NB-LRR 和 PPR 基因产生的phasiRNA在侵染后显著上调。这些miRNA和phasiRNA的生物学功能证明在疫霉菌感染大豆中的防御中有重要的调控作用。