2017年12月2日,2017新疆植物学会、2017年学术年会、暨第三届植物学科研究生论坛在新疆农业大学顺利召开,百迈客作为独家赞助商,以新一代高通量测序技术领跑者的身份出席了此次学术会议。 会议主要围绕 “十九大报告中的生态文明建设——新疆植物学工作者的责任与挑战”这一主题,会议主要包括以下议题:1、植物多样性与生态系统服务功能 2、人类活动与气候变化对植物多样性的影响 3、植物种间相互作用与生态系统稳定性 4、干旱区重要植物类群系统演化与格局 5、干旱区植物抗逆的分子机理 6、中亚区域植物资源的分布及合理利用。本次会议旨在为新疆植物资源的利用与保护及生态环境的可持续发展献计献策。会上重点交流了新疆生态文明建设中植物科学相关领域在 2017 年取得的最新研究成果,介绍了国内外植物科学研究的最新动态,并对新疆植物科学未来的发展趋势进行了展望。 针对“植物多样性与生态系统服务功能”这一主要议题,百迈客公司周剑南博士在报告中指出,目前,很多新疆地区特有的植物还没有参考基因组,严重限制了对这些植物的研究和保护。 百迈客拥有新一代高通量测序技术的丰富经验,能够提供包含三代基因组,光学图谱,Hi-C,全长转录组,全转录组等技术在内的一揽子解决方案。这些新一代测序技术的应用,能显著提升新疆地区植物学研究的科研水平,保护新疆特有的种质资源和生态环境,为建设祖国的西北边疆做出贡献。...

The comprehensive liver transcriptome of two cattle breeds with different intramuscular fat content 不同肌内脂肪含量的两种牛中肝脏转录组研究 发表杂志:Biochemical and Biophysical Research Communications 影响因子:2.466 PMID:28669724   摘要 肌内脂肪(IMF)含量是牛肉质量的重要决定因素。晋南牛和西门塔尔牛之间的IMF含量有显着差异。在这里,为了鉴定与IMF沉积有关的候选基因和网络,研究人员深入探索了这两种牛中肝脏的转录组结构。研究人员对5个晋南牛和3个西门塔尔牛的肝脏进行转录组测序,产生了约4139M reads。共检测到124个差异表达基因(DEGs),在晋南牛肉中,有53个上调,71个下调。 此外,共鉴定了1282个潜在的新基因。GO分析显示,这些DEGs(包括CYP21A2,PC,ACACB,APOA1和FADS2)在脂质生物合成过程、胆固醇酯化调节、胆固醇逆向转运和脂蛋白脂肪酶活性的调节中显着富集。参与丙酮酸代谢途径的基因也显著过表达。此外,本研究还确定了一个与脂质代谢有关的相互作用网络,这可能是导致牛在基因组中沉积的原因。由此推论,参与调节脂质代谢的DEGs可能在IMF沉积中起重要作用。综上所述,研究者提出了一组候选基因和相互作用网络,可以与IMF沉积相关联,并用作牛的育种中的生物标志物。   背景 牛肉是人类食物最重要的蛋白质来源之一。在不同品种的牛之间,生长速度,肌肉质量和肉质存在显着差异。津南黄牛是我国五大黄牛品种之一,以其肉质鲜嫩,纹路鲜明而闻名。相比之下,源自瑞士的西门塔尔牛是世界上大量喂养的品种,主要用于生产好的乳品或肉质的品种,它们的生长速度较快,瘦肉含量高,以至于肌内脂肪(IMF)含量以及嫩度低于晋南牛肉。 IMF含量和肌肉纤维特性是肉品质的主要决定因素,包括感官特性(嫩度,多汁性和风味)和营养价值。IMF含量与牛肉感官品质性状呈正相关。西门塔尔牛和晋南牛的IMF含量差异使其成为比较基因组学研究的重要材料,用来研究牛肌内脂肪酸沉积的分子机制。 肝脏与脂肪组织和骨骼肌是哺乳动物脂质代谢和其他代谢过程中最重要的器官之一。它是非酯化脂肪酸吸收、氧化和代谢转化的中心器官。此外,它具有从头脂肪生成,细胞质三酰甘油储存,从葡萄糖和其他非脂质前体合成脂肪酸的酶活性。随着高通量测序技术的发展,已有对猪和乳鸽肝脏进行转录组研究,以探索影响IMF成分的潜在候选基因。日本黑色longissimus dorsi和荷斯坦黑白花牛转录组报告显示,在日本黑牛中,具有较强IMF沉积能力特征的差异表达基因中,大多数表达上调。并且鉴定了一个与细胞形态和脂质代谢相关的基因网络。然而,并没有两种不同IMF水平的牛肝脏比较转录组学研究。 在该研究中,使用RNA-Seq方法来分析西门塔尔牛和津南牛的肝脏转录组数据。这项研究的主要目标是确定差异表达的基因和相互作用网络,这可能有助于牛的肌内脂肪酸组成研究。 另外,该研究鉴定的候选基因可能会对牛的分子育种有帮助。   材料和方法 为了消除性别差异,该研究全部选择雄性牛。3头西门塔尔和5头晋南牛,生长1.5年,屠杀后30分钟内取肝脏组织,在液氮中快速储存,提取总RNA。 测序平台:北京百迈客生物科技有限公司Illumina Hiseq 3000平台,PE150 分析平台:百迈客云科技有限公司(BMKCloud) 分析内容:1.低质量reads质控; 2.参考基因组比对(Bos taurus参考基因组,版本UMD 3.1.1); 3.基因表达量和差异表达分析; 4.差异表达基因的功能富集分析; 5.蛋白质互作分析;   结果 1.西门塔尔牛和晋南牛肝组织RNA测序结果 使用Illumina Hiseq 3000平台对西门塔尔(n = 3)和晋南(n = 5)牛的肝进行转录组测序。质控后共获得61.33 Gb数据,约为牛基因组的23倍。8个样本的Q30均大于93%。与参考基因组比对率均在80.27%-85.48%范围内(表1)。 表1.RNA测序数据和比对结果统计 2.新基因的鉴定和注释 利用Cufflinks软件来鉴定西门塔尔牛和晋南牛的新基因。该研究中共检测到1282个潜在的新基因。 其中,有1043个基因通过与数据库(NR,Swiss-Prot,GO,COG,KOG,Pfam和KEGG)比对进行了注释。 值得关注的是,在Swiss-Prot蛋白质数据库中可以注释到364个新基因,这意味着它们是潜在的蛋白质编码基因,在之前的牛参考基因组中没有注释。 此外, GO和KEGG数据库中分别注释548和371个新基因。 3.差异基因表达分析 使用DESeq R软件包鉴定西门塔尔牛与晋南牛的差异表达基因(DEGs)。将Fold Change≥2且FDR<0.05作为筛选标准,共鉴定了124个显着的DEGs,其中晋南牛中有53个(42.7%)上调,71个(57.3%)下调(图2)。西门塔尔牛和晋南牛中17个新基因有显著差异。一些转录本在丰度上有很大的差异,如ENSBTAG00000047322(|log2-fold change| = 7.16),血红蛋白亚基beta(HBB,|log2-fold change|= 3.76)和超氧化物歧化酶1(SOD1,|log2-fold change |= 8.38)它们被认为与肌内脂肪酸组成相关的候选基因。 图1.两种牛中124个差异表达基因热图 4.差异表达基因功能富集分析 为了深入了解西门塔尔牛和晋南牛肝中差异表达基因的生物学关系,研究人员将差异表达基因进行GO,KEGG富集分析。结果显示, GO生物学过程中显著富集了23个terms,主要包括催化活性(GO:0043086),脂质生物合成过程(GO:0008610),胆固醇酯化调节(GO:0010872), 逆转胆固醇转运(GO:0043691)和脂蛋白脂肪酶活性的调节(GO:0051004)的负调节(P < 0.05)。 共有4个KEGG通路被显著富集(P <0.05),主要包括造血细胞谱系(bta04640),细胞粘附分子(CAMs,bta04514),丙酮酸代谢(bta00620)和T细胞受体信号传导通路(bta04660)(图2)。 图2.两种牛的差异表达基因GO富集中前20个显著富集的terms和KEGG通路分析 5.蛋白质相互作用分析 为了解西门塔尔牛和晋南牛肝脏中DEGs的相互作用,研究人员利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件进行了蛋白质 - 蛋白质互作网络分析。共鉴定了9个网络, 有趣的是,第二个网络与脂质代谢,分子运输和小分子生物化学相关,该网络包括乙酰辅酶A羧化酶β(ACACB),载脂蛋白A1(APOA1),脂肪酸去饱和酶 2(FADS2)和其他脂代谢相关基因(图3)。 图3.两种牛中差异表达基因的蛋白-蛋白互作网络图 结论 综上所述,该研究系统地比较了晋南牛和西门塔尔牛的肝脏转录组差异。 总共有124个被识别出来。 与这两个品种的IMF沉积差异一致,这些DEGs在脂质生物合成和代谢相关的生物过程和途径中富集。 与脂质代谢有关的相互作用网络也被确定。 总的来说,该研究提供了与IMF沉积有关的潜在的候选基因和调控网络,这对于产生更好的肉质的牛饲养是有用的。   创新点 在前期的报告中有较强IMF沉积能力特征的牛转录组研究,但是并没有两种不同IMF水平的牛转录组学研究。该研究中,使用RNA-Seq方法来分析两种不同IMF水平的牛肝脏转录组数据。鉴定了差异表达的基因和相互作用网络,这一结果为牛的肌内脂肪酸组成研究奠定了基础。此外,该研究鉴定的候选基因可能会对牛的分子育种有帮助。   参考文献 Xi W, Zhang Y, Zhang X, et al. The comprehensive liver transcriptome of two cattle breeds with different intramuscular fat content[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017:1018-1025....

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云平台深度解析-小麦与禾谷胞囊线虫在侵染初始阶段的转录组学变化 Transcriptional responses of wheat and the cereal cyst nematode Heterodera avenae during their early contact stage 小麦与禾谷胞囊线虫在侵染初始阶段的转录组响应 杂志: Scientific Reports  影响因子:4.259 PMID:29101332   研究背景: 植物寄生线虫(PPNs)已给许多植物带来了巨大损害。禾谷胞囊线虫Wollenweber隶属禾谷胞囊线虫(CCNS),出现在80%的中国小麦种植区,致使小麦感染并减产30%到100%。许多寄生线虫可繁殖幼虫,幼虫用感官定位宿主,这种复杂的行为与感官能力(如嗅觉、味觉、温湿度感应)有关。可在植物根部与线虫初始接触过程中采取措施进行预防,因此了解寄生虫宿主互作机制具有重要意义。过去大部分研究集中在线虫侵染宿主后不同阶段的转录组学分析,而没有关于侵染前(早期接触阶段)互作机制的探讨。今年11月3日中国农业科学院作物科学研究所的老师们在Scientific Reports 发表了一篇关于小麦和禾谷胞囊线虫在接触早期转录响应机制的研究,填补了国内外研究空白,第一次对小麦和禾谷胞囊线虫互作早期转录组响应进行了系统性的描述。   材料和方法 实验组:Wenmai19小麦幼苗(根长2–3 cm )与J2s;对照组:仅Wenmai 19小麦幼苗或仅J2s。 处理3h后提取RNA测序。实验组小麦根尖染色镜检。每组三个重复。测序后分别对小麦和线虫DEGs进行了鉴定注释,并对线虫的效应基因进行了预测及BT-PCD验证。 测序平台:百迈客HiSeq4000测序平台 分析平台:百迈客云平台(BMKCloud) 研究结果: 1.转录组分析采样时间点确定 CCN易感小麦品种Wenmai19吸引禾谷胞囊线虫J2s。小麦根尖周围聚集的J2线虫数量在3h达到峰值,且J2s未渗入根内部。选择此时小麦根、线虫样品进行转录组分析。 2.小麦根尖转录组数据 实验组、对照组小麦根尖样本共得到52.23 Gb的clean reads,每个样本≥8.25Gb,Q30≥90.4%。每个样品的clean reads与小麦参考基因组比对效率为64.0%至67.3%,并与唯一或多基因组位置匹配(表1)。小麦转录组中,共发现109,496个unigenes,包括9152个新基因。与Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG等数据库比对后,共注释了6,780个新基因。数据重复性较好。 表1 小麦参考基因组比对结果 3.小麦基因表达响应分析 实验组、对照组基因表达分析得到93个差异表达的unigenes(66个下调,27个上调),FDR<0.05和FC≥1.5(图1)。对12个DEGs进行了qPCR验证,其中11个DEG的表达模式与mRNA测序结果一致。结果表明即使未受感染,J2线虫在小麦根部聚集也会触发小麦的响应。 图1 实验组对照组小麦DEGs的火山图 功能注释的结果表明,所有的DEG都能与Nr数据库比对上,其中一些在Swiss-Prot、GO、KEGG、COG数据库中也有注释信息(表2)。 表2 小麦与禾谷胞囊线虫的DEGs的功能注释 GO富集分析将小麦DEGs分为28个功能组,归为3大类:生物学过程(60个)、细胞成分(54个)、分子功能(68个)(图2a)。 图2a小麦根尖unigenes 和DEG unigenes的GO分类 在生物过程类别中,与所有小麦根的unigenes相比,大部分DEG与代谢过程、单一生物过程、对刺激的反应相关。细胞成分类别中更多DEGs位于细胞外区域。 在分子功能类别,与所有unigenes相比,DEG更多富集于营养储存活性,抗氧化活性,电子载体活性,酶调节活性和催化活性等GO分类。 KEGG通路分析来确定DEGs的生物学功能。将31个DEG分配到21个KEGG通路(图3a)。最多数量DEGs归类于苯丙素生物合成通路,其次是谷胱甘肽代谢,苯丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢。6个DEG与苯丙烷相关通路有关,在线虫侵染的小麦根中全部下调,其中两个基因Traes_1AS_F9013A945和Traes_2AS_EE549925C,经qPCR验证有相似的表达模式。 图3a.小麦根尖DEGs的KEGG分析 COG注释后,小麦29个DEGs被分为6个COG功能类别,包括能源产生于转换;次级代谢物合成运输和代谢;仅一般功能预测;翻译后修饰、蛋白质转换,分子伴侣;氨基酸转运代谢;碳水化合物转运代谢(图4a)。 图4.DEGs的COG功能注释 a 小麦根系 b禾谷胞囊线虫 4.小麦DEGs生物胁迫通路图谱 MapMan分析显示小麦许多DEGs能比对到生物胁迫通路(图5):29个小麦DEGs能和生物胁迫通路相关的33个数据点比对上,DEGs包含过氧化物酶,谷胱甘肽S转移酶,激素信号传导(生长素和茉莉酸),发病相关蛋白和次级代谢物。这些DEGs大多数在生物胁迫通路中表达下调。qPCR分析其中8个DEGs,除一个之外,其他的表达模式与测序结果一致。 图5.小麦DEGs生物胁迫通路 在氧化还原反应通路中,3个DEGs与过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶通路比对上,且全部下调,表明氧化还原反应减弱。在激素信号传导通路中,生长素和茉莉酸(JA)通路各包含2个下调的DEGs。 有7个数据点与6个下调的DEGs比对上,几乎都与苯丙素类黄酮代谢通路有关。编码PR蛋白的防御基因有3个下调的DEG,1个下调的DEG,与细胞壁蛋白比对上,1个表达上调的DEG与细胞壁修饰通路有关。 2个下调的DEG,2个上调的DEG可比对到蛋白酶和泛素相关蛋白水解通路。 1个上调的DEG与突发性呼吸相关,隶属乙烯应答元件结合蛋白家族的转录因子,可比对到Traes_5DL_41E3B1B23基因,是一个上调DEG(注释ERF071)。 5.CCN的转录组数据 实验组、对照组CNN样本得到30.47Gb的clean reads,每份样本≥4.13Gb,Q30≥89.1%。共得到194,662个转录本和80,124个unigenes(表3)。unigenes的总长、N50长度、平均长度分别为61,659,712bp,955bp、769.55bp。长于1 kb的unigenes有15,197个。每个CCN样本与组装数据的比对效率在73.2%至79.2%之间。根据Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam数据库,共注释了43741个unigenes。CCN样本重复性良好。 表3 禾谷胞囊线虫的组装转录本及unigene一览 6.CCN基因对于小麦根吸引的响应分析 实验组、对照组CNN比较得到879个DEGs(FDR <0.01和FC≥2)。867个上调,仅12个下调。对10个DEG的表达模式进行qPCR验证,结果与测序结果一致。表明CCNs通过小麦根的刺激激活,大部分基因上调。 DEGs的功能注释,GO富集分析把258个DEGs归类到三大类的36个功能组中:生物过程(159个)、细胞成分(107个)、分子功能(223个)(图2b) 图2b 禾谷胞囊线虫unigenes 和DEG unigenes的GO分类 KEGG分析将247个DEGs归到125个KEGG路径,50个最显著的通路中,核糖体通路有最多的DEG数(64个)(图3b),其他DEG较多的通路为细胞色素P450外源物代谢,谷胱甘肽代谢和Toll样受体信号通路。表明CNN被小麦根部吸引时CNN的蛋白翻译更活跃。 图3b.禾谷胞囊线虫DEGs的KEGG分析 共386个DEGs归类于22个COG功能类别。前四个DEG数目最多的COG类别为仅一般功能预测(90个);翻译,核糖体结构和生物起源(65个);能量产生与转化(45个);氨基酸转运代谢(44个)(图4b)。 7.CNN效应基因预测 搜集PPNs的351个已知效应子基因序列,并将CCN的DEGs与这些序列进行比对。推测6个DEG与已知效应基因14-3-3,几丁质酶,β-1,4-内切葡聚糖酶,果胶酸裂解酶或组织蛋白酶具有同源性(表4)。比对上的效应基因的描述和DEG的Nr注释一致。对这些DEGs结构域进行了预测,结果也与基因描述一致(图6,表4)。当J2线虫与小麦根接触时,编码候选效应蛋白的DEGs全部上调。 表4.根据禾谷胞囊线虫DEGs预测的效应基因 图6 禾谷胞囊线虫的6个候选效应基因的结构域 8.效应基因的植物防御抑制验证 选择两个预测的效应基因c68622.graph_c0和c72543.graph_c0,在本氏烟草中进行程序性细胞死亡(BT-PCD)抑制来验证其抑制植物防御的能力。 BAX加入后,在c68622.graph_c0,没有明显坏死,而c72543.graph_c0则明显坏死(图7)。BT-PCD抑制试验的两个重复结果一致。表明前者抑制BT-PCD,而后者不抑制。c68622.graph_c0是来自H.avenae DEGs的候选基因,可能在抑制植物防御中发挥作用。 图7.(a)c68622.graph_c0和(b)c72543.graph_c0在本氏烟草中BT-PCD的试验 结论: 本文拟研究在线虫与小麦根部在早期接触阶段的相互作用机制,通过mRNA测序对小麦和禾谷胞囊线虫在接触早期的转录组响应进行了分析,鉴定了的宿主小麦根部的93个DEGs(27个上调,66个下调),寄生线虫的879个DEGs(867个上调,12个下调)。其中一些小麦DEGs(主要是下调的)与生物胁迫途径相关,线虫DEGs中几个推定的效应基因表达上调,线虫的几丁质酶样效应基因能抑制本氏烟草中BAX引起的细胞程序性死亡。以上结果表明,在寄生初始接触阶段,线虫的响应比小麦更活跃。寄生虫的响应主要与基因(包括至少一个抗植物防御效应基因)的上调相关,而宿主响应主要与某些防御基因下调相关。     创新点: 第一个对小麦和禾谷胞囊线虫互作早期转录组响应进行系统性描述的研究。 参考文献: Chen C, Cui L, Chen Y, et...

Transcriptome Profiling of Watermelon Root in Response to Short-Term Osmotic Stress 短期渗透胁迫下西瓜根组织的转录组研究 杂志: PLOS ONE 影响因子:2.806 PMID:27861528     研究背景: 干旱是影响农业生产力、限制物种分布的重要因素。干旱会影响植物某些生理生化过程(如蒸腾作用、光合作用、呼吸作用、碳水化合物和激素代谢)。植物进化出多种应对机制(包括逃旱性,避旱性和抗旱性),这种机制涉及精细复杂的代谢网络及多分子通路间的相互作用。 西瓜富含必需营养成分(如糖、番茄红素、对心血管有益的氨基酸类),是一种在世界范围内广泛种植的瓜类作物。干旱会减少西瓜产量,栽培西瓜较野生西瓜抗旱性更强,但相关研究较少。M08是一种栽培西瓜近交品种,抗旱性强。为了解栽培西瓜根系对渗透胁迫响应分子机制及相关调控网络,本研究进行了渗透胁迫下西瓜根系的比较转录组学研究。 材料和方法 PEG6000处理的M08植株幼苗根系,依据处理0、3、6、12、24h时表型和Cla007307 (WRKY) and Cla006761 (MYB)基因转录水平来确定mRNA测序时间点。实验组(T-1,T-2,T-3),与对照组(CK-1,CK-2,CK-3)一起进行mRNA测序。 测序平台:百迈客Illumina HiSeqTM 2500平台 分析平台:百迈客云平台(BMKCloud)具体分析如下: 矫正后clean reads比对到西瓜参考基因组(TopHat ),基于DESeq进行差异表达基因(DEGs)分析(FC≥2,FDR<0.01),随后进一步进行GO分析、GO富集、KEGG通路分析。 研究结果: 转录组测序时间点选择 西瓜幼苗在渗透胁迫下,6h时出现枯萎,12h和24h时出现严重枯萎(图1A)。 Cla006761上调并在6h时达到最高,Cla017928下调在6h达到最低值(图1B)。结合幼苗表型及Cla017928和Cla006761的动态表达结果,选择处理6h的样本进行RNA测序。 图1A M08幼苗在渗透胁迫处理不同时间的表型特征 图1B 渗透胁迫下P5CS、MYB基因表达的动态变化 测序结果 6个文库共得到32.99 Gb的clean reads,每个文库>40M(表1)。unique mapped reads的比例为8.513%到86.10%,测序数据质量高。 表1.测序数据  qRT-PCR验证18个不同表达水平的基因,验证结果与测序结果一致。生物学重复间相关性评估结果显示相同处理组高度相关,CK和实验组相关性弱。以上结果均表明测序数据结果可靠。 DEGs鉴定 基于DESeq进行DEGs分析,共鉴定出渗透胁迫下5246个差异表达基因,其中2753个上调,2493个下调。DEG包含大量不同的基因,说明西瓜根系对干旱响应涉及复杂的调控机制。 GO分类和KEGG分析 将DEGs在与COG(2174),GO(4528),KEGG(1203),Swiss-Prot(3954)、NR(5173) 比对后,共注释了5175个DEG 。用BLAST2GO检索GO数据库中的DEG并用WEGO进行GO功能分类。将4528个DEG归为以下三类:生物学过程(4148),分子功能(3670)和细胞成分(4177)(图2)。 图2.GO分类 富集的GO terms包含缺水响应、高渗盐度响应、乙烯响应。此外几个高度富集的terms(植物型超敏响应调节、损伤响应、真菌防御响应、防御响应突发性呼吸)在西瓜根部不同胁迫响应中相互作用,与其他植物中的结果一致。 一些与根生长相关的生物学过程是显著抑制的,如细胞增殖、分生组织生长调节、有丝分裂细胞周期的G2/M转换、细胞板形成的胞质分裂、核糖体生物起源、核糖体、微管、翻译、DNA复制调控、DNA复制起始等。说明PEG诱导的渗透胁迫可能会抑制西瓜根系生长。 植物激素在不同胁迫响应中起重要作用,本研究中大部分涉及激素介导的信号传导途径、乙烯响应、水杨酸生物合成过程的基因表达上调。 蛋白折叠影响蛋白质功能,破坏内质网腔蛋白折叠的多种信号可激活未折叠的蛋白质发生响应,甚至致使细胞程序性死亡(PCD)。内质网未折叠蛋白质响应是本研究中高度富集的term,表明渗透胁迫会影响蛋白折叠。在渗透胁迫时,根尖分生组织自噬PCD激活,根尖优势丧失,根系结构发生重构来适应渗透胁迫。富集到的GO terms包含细胞程序性死亡调节、根形态发生,表明渗透胁迫下PCD程序可能在根尖分生组织中激活,同时发生根系结构重构。 KEGG分析结果显示共825个分配到108个不同的生化途径。DEG最多的前5个途径分别是核糖体、植物激素信号转导、植物病原体相互作用、嘌呤代谢、淀粉蔗糖代谢途径(图3)。其中核糖体途径变化显著。大部分核糖体通路中的基因都是下调的,与GO分析结果一致。 图3.KEGG分析   渗透胁迫响应的保护基因 参与渗透调节的基因 在渗透胁迫条件下,相容性溶质分子(如脯氨酸,甜菜碱和海藻糖)会增加,来维持细胞膜结构,细胞膨压和水平衡。P5CS是高等植物脯氨酸合成的限速酶,鸟氨酸氨基转移酶(OAT)是脯氨酸合成鸟氨酸途径中的脯氨酸合成酶。在渗透胁迫下,根中P5CS(Cla017928)和OAT(Cla019569)表达下调。而编码脯氨酸脱氢酶的Cla016474(ProDH)上调。在渗透胁迫下TPS基因(Cla019181,Cla010101和Cla009709)和TPP基因(Cla005675,Cl008123,Cla006270和Cla014481)表达上调,参与蔗糖和肌醇半乳糖苷代谢的基因显著上调,另外四个淀粉酶基因也是上调的。 活性氧(ROS)清除 ROS是有氧代谢过程中重要信号转导分子及毒副产物。非生物胁迫(如干旱、高盐、洪水、寒冷和炎热)会扰乱细胞代谢平衡,致使植物ROS生成过量,从而损伤蛋白质,脂质,碳水化合物和DNA。突发性呼吸氧化酶同系物(Rboh)蛋白与ROS产生有关。植物进化出一些高效酶(如超氧化物歧化酶,过氧化氢酶,过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶),以及非酶抗氧化剂(ASH、GSH)来清除过量的过氧化物自由基。在本研究中,编码Rboh的四个基因显著上调。抗坏血酸过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶、单脱氢抗坏血酸还原酶,脱氢抗坏血酸还原酶,谷胱甘肽过氧化物酶以及大部分谷胱甘肽-S-转移酶和过氧化物酶基因表达上调,但超氧化物歧化酶基因Cla011317表达下调。这些结果表明渗透胁迫可能诱导复杂的抗氧化网络。此外也富集到与维持细胞氧化还原稳态相关的硫氧还蛋白和谷氧还蛋白相关转录本。 其他渗透保护相关DEGs MATE是一组新发现在胁迫响应中发挥重要作用的转运蛋白。本实验共得到18个MATE转运蛋白相关的DEG。水通道蛋白是一种膜蛋白,能促进水分跨膜转运并维持细胞水平衡。本研究中,共8个编码水通道蛋白的基因显示出差异表达。LEA蛋白是重要的细胞脱水保护蛋白,其表达量与耐脱水性相关,在渗透胁迫下有两个LEA(Cla015386和Cla009416)上调。此外编码分子伴侣(如热休克蛋白(HSP),分子伴侣,DnaJ样蛋白)的DEGs也是差异表达的。 蛋白激酶,磷酸酶和转录因子相关的DEGs 渗透胁迫诱导植物中的钙信号,本研究涉及Ca2 +结合蛋白的DEGs在渗透胁迫下表达上调。Map激酶级联成员在渗透胁迫中起重要作用,本研究检测到13个编码MAP激酶的DEGs,几个与SnF1相关蛋白激酶,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和磷酸酶有关的DEGs表达上调。在磷脂信号系统中,磷脂酶催化IP3和DAG等信使形成以调节胁迫响应基因的表达。在本研究中检测到与磷脂酶相关的DEGs(包括PLA、PLC、PLD)。许多功能基因的表达主要受特定转录因子调控。我们结果中也列出了转录因子家族的DEGs。     7.植物激素相关DEG 植物激素介导植物对生物/非生物胁迫的响应,对于植物适应环境变化具有重要意义。本研究结果中列出了与脱落酸(ABA),生长素,细胞分裂素,赤霉酸(GA),乙烯和茉莉酸(JA)等植物激素信号相关的DEGs。 编码ABA生物合成关键酶NECD的Cla009779和Cla005404基因表达上调,与乙烯合成相关基因(如ERF转录因子、ACS、ACO等)的表达上调。吲哚-3-乙酸(IAA)是植物中的主要生长素,由色氨酸(Trp)依赖/非依赖性途径合成。YUC家族和TAA家族的色氨酸氨基转移酶是Trp依赖途径中的IAA生物合成中的关键酶。我们结果中,两个YUC和一个TAA表达下调,生长素转运蛋白基因如LAX和PIN表达也下调。GA是调控植物生长发育的重要植物激素,本研究中编码GA生物合成关键酶的基因(Cla021351)表达下调,而编码GA2-氧化酶(GA2ox)的转录本表达上调,这可能使GA的内源性水平和生物活性下降。此外,茉莉酸和细胞分裂素的生物合成途径的转录本也受到渗透胁迫的影响。      8.其他DEGs 许多与细胞分裂和根生长相关的DEGs表达下调,如CYC、CDK、MAP、Ran、E2F、DOF、核糖体、肌动蛋白和微管蛋白等。 泛素26S蛋白酶体系统(UPS)可去除非生物胁迫导致的错误折叠或损伤蛋白质。E3连接酶除在UPS中发挥重要作用外,还可调节ABA依赖的应激信号。本研究得到了许多E2结合酶、E3-蛋白连接酶相关的DEG,说明渗透胁迫可诱导UPS去除机制和E3调节机制的发生。 结论: 渗透胁迫影响西瓜的生长、品质和产量。增强西瓜对高盐,缺水等因素引起的渗透胁迫耐性是提高生存率的有效途径。根系是重要的吸水组织,参与渗透胁迫的初始反应。为了更好地阐述西瓜根系组织应对短期渗透胁迫的分子机制,将西瓜自交系M08用20%的PEG6000处理6h,未处理根组织作对照,进行了全基因组差异基因表达分析。RNA-seq得到32.99Gb的高质量数据。数据集阐述了基因表达谱,鉴定出5246个差异表达的基因,GO富集和KEGG分析表明,短期渗透胁迫影响渗透调节,信号转导,激素应答,细胞分裂,细胞周期和核糖体等过程,M08根组织对短期渗透胁迫响应适应过程与渗透调节,ROS清除、渗透胁迫信号转导和根系生长抑制等通路有关(图4)。 图4.渗透胁迫下西瓜根系DEGs总览 创新点: 这是第一个栽培西瓜品种根系渗透胁迫响应的比较转录组学研究,为深入探讨西瓜根系渗透胁迫响应分子机制提供了新的思路。 参考文献: Yang Y, Mo Y,...

Dietary Propolis Ameliorates Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis and Modulates the Gut Microbiota in Rats Fed a Western Diet 大鼠饮食中添加膳食蜂胶可改善葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎并调节肠道菌群 杂志: nutrients 影响因子:3.550 PMID:28805735   得了肠炎怎么办,多吃点蜂胶吧,是的,你没有听错,蜂胶可是个好东西, 蜂胶味微甘、性平,有润肤生肌、消炎止痛的功效,对于结肠炎、口腔溃疡、胃溃疡等有一定的辅助疗效。今年中国农业科学院蜜蜂研究所的王凯老师在nutrients 发表了一篇关于杨树来源蜂胶改善结肠炎症状的文章,证明膳食添加0.3%浓度蜂胶添加能显着改善大鼠结肠炎症状并改变肠道菌群多样性。可以作为一种新的IBD治疗辅助手段呢。   研究背景:   炎性肠病(IBD)是一种胃肠慢性炎症疾病。包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。IBD确切病因还不确定,但诱因可能为遗传易感性、肠道菌群失调、环境因素,饮食和生活方式等因素。近年来随着饮食习惯的西式化转变,发展中国家IBD发病率迅速增加。食疗对肠道菌群代谢和多样性的影响较大,是一种IBD的干预手段。 富含多酚的食物对人体健康有益,多酚具强抗氧化性,可清除自由基,也可调节细胞氧化还原信号传导途径,可通过抑制多种炎症介质产生和释放发挥抗炎作用。蜂胶是一种重要的对健康有益的树脂物质,含丰富的多酚类化合物。蜂胶提取物可能通过调节关键炎症介质的产生及阻断NF-κB的激活发挥抗炎作用,然而目前还缺乏证据证明其可改善肠道健康。本文拟研究在大鼠西式饮食中添加中国蜂胶提取物是否可以改善DSS诱导的结肠炎的病情,以及肠道菌群在这种保护机制中的起到的作用。 材料和方法 材料:6周龄185g左右的雄性大鼠。 实验组:4组(每组8只),分别添加不同浓度(0%,0.1%,0.2%和0.3%)的中国蜂胶提取物喂食3周。仅在第2周内在饮用水中添加DSS(3%)。 对照组:5只,不添加DSS,只喂食西式饮食 测序平台:MiSeq Illumina 分析平台:百迈客云平台(BMKCloud) 方法: DAI指数评估:第二周到第三周内基于体重变化,粪便性状,肠血及综合状态来评估 2.组织镜检:3周后采集组织包埋染色,基于细胞浸润和组织损伤程度进行评分。 3.短链脂肪酸(SCFA) 分析:去离子水稀释盲肠消化物作内标,气相色谱测定大鼠盲肠内容物中乙酸根,丁酸根,丙酸根,总SCFA含量。 4.肠道菌群分析:盲肠内容物提取DNA,扩增16S rRNA序列并测序组装。基于97%的序列相似性将高质量标签聚类成OTU进行分析,并进行α和β多样性分析、主坐标分析(PCoA)、(LDA)效应大小分析。 研究结果:   蜂胶对于结肠症状的影响 实验组每日记录DAI数据。DSS的加入后,DAI显着增大(p <0.001)。对照组DAI为零。0.3%蜂胶添加显着降低了DAI(p <0.01或p <0.001)(图1a D6至D9)。DSS治疗期间,喂食0.1%蜂胶的大鼠体重增加显著低于对照组,但0.2%和0.3%的蜂胶添加不改变大鼠的体重增加。最后实验组和对照组体重没有显著差异(图1b),肝,脾,肾等器官和脂肪重量也没有显著差异(表1)。然而0.3%蜂胶喂养的大鼠比对照组结肠长度/重量比更大(图1c,p <0.05)。 DSS处理组的组织学镜检观察到严重的粘膜炎症(如溃疡,水肿,隐窝损伤和肠上皮浸润)。与0%蜂胶组中大鼠相比,0.3%蜂胶减少了DSS诱导的结肠炎的组织学症状(图1d)。 表1.器官及脂肪重量  图1蜂胶添加对DSS诱导的结肠炎严重程度的影响。(a)实验期间的疾病活动指数(DAI); (b)实验结束时的体重增加;(c)实验结束时结肠长度/重量比; (d)0%蜂胶组,0.3%蜂胶组、对照组的HE切片;(e)大鼠组织学评分(0为无炎症,6为最大组织损伤和细胞浸润) 2.  蜂胶对SCFA水平的影响 与0.1%蜂胶组相比,0.2%蜂胶组盲肠中乙酸盐和总SCFA低。没有观察到其他SCFA水平的差异。盲肠组织重量,食糜重量和pH值不受蜂胶处理的影响。 3.  蜂胶改变结肠炎大鼠肠道菌群结构 16S rRNA系统发育比较0%蜂胶,0.3%蜂胶和非DSS处理组的微生物群体。测序后得到平均37,362(20,793-51,692)个有效标签。具有至少97%相似性的序列聚类为操作分类单元(OTU)。Shannon指数表明微生物群落的α多样性,DSS处理组显着降低,蜂胶显着增加微生物多样性(p <0.05,图2a)。根据对照组,0%蜂胶组,0.3%蜂胶组三组间加权UniFrac距离评估微生物群落,结果显示补充蜂胶使微生物β多样性具有显著差异(p <0.001,图2b)。此外进行加权PCoA分析研究肠道菌群结构,发现蜂胶和DSS能调节肠道菌群(图2c)。(图2d)三组重叠OTU数据的维恩图表明在所有样本中,共1405个OTU中有722个是所有样本共有的。而0.3%蜂胶组的440个OTU与另外两组不同。在门水平,0%蜂胶组和对照组中以厚壁菌门和类杆菌门为主,其它门占比较少。但0.3%蜂胶处理组(图2e)中这两个门的微生物比例要小得多,而变形杆菌,酸杆菌和其他微生物占比较高 图2 蜂胶改变了结肠炎大鼠肠道微生物的组成。16S rRNA测序检测对照组,0%蜂胶和0.3%蜂胶组盲肠消化物微生物群。(a)Shannon多样性指数分析α多样性,两组间显着性差异* p <0.05,** p <0.01;(b)加权UniFrac距离分析组间的β多样性。两组间显着性差异***p<0.001; (c)基于未加权的UniFrac分析得到肠道微生物群的PCoA图;(d)OTUs的维恩图显示三组菌群差异;(e)门水平优势菌群的相对丰度 4.  蜂胶改变结肠炎大鼠中肠道菌群的主要模式 为了鉴定与蜂胶处理减轻结肠炎症状相关的特定细菌类群,进行LEfSe分析比较肠道微生物群(图3)。在对照组,DSS(0%蜂胶)和0.3%蜂胶组(LDA阈值log 10> 4.0)中,共有13个类别的菌在相对丰度上有显著差异。对照组大鼠显示更高丰度的细菌类杆菌,以及较低丰度的分类乳酸杆菌,乳酸杆菌科和乳酸杆菌。...

PMID: 27934932 杂志:Scientific reports 影响因子:5.228   研究背景:目前蛋白编码基因的功能已有了比较广泛的研究,但对非编码RNA(ncRNAs)功能的了解还非常少,先前ncRNAs被简单视为转录过程中内含子和基因间区积累的碎片。近期的研究发现,ncRNAs可能在很多生物、病理和发育过程中发挥关键的作用,比如它们可以调节mRNA的翻译,对细胞行为起决定性作用。但是到目前为止,我们对大部分ncRNAs的确切功能,甚至他们的表达谱还知之甚少。ENCODE计划在人lncRNA和小鼠组织特异性元件的鉴定方面取得了很大进展,但是很少有研究报道lncRNA在小鼠的脑、心脏和肝脏发育中的作用。此外,以往的研究表明非编码基因比编码基因对器官和年龄因素有更高的敏感性。因此,对大鼠不同发育阶段中不同器官的非编码基因的全面鉴定和注释就显得非常重要。 公共原始数据获取: 从GEO数据库中下载得到Ying等人上传的原始测序数据(GSE53960)。数据集中包含来自32只大鼠的320个bodymap样本(每只大鼠包含肾上腺、脑、心脏,肾、肝、肺、骨骼肌、脾脏、胸腺、睾丸或子宫10种不同器官)的转录组测序数据。Ying等选取了2周、6周、21周和104周四个时间点,每个时间点处死雌、雄两只大鼠,进行四次生物学重复。 技术路线: 实验结果: 1.大鼠非编码基因表达谱 为了获得大鼠非编码基因表达谱的概览,作者首先提取了FPKM>0.01 的3,458个非编码基因的表达值,其中54.8%(1,895)是假基因、33.5%(1,158)是miRNA、6.8% (237)是lncRNA(Fig.1a)。分层聚类分析显示,非编码基因的表达谱明显按器官类型聚类,比编码基因表现出更高的器官特异性。PVCA分析发现在数据集中方差贡献率最多高的是器官(62.94%)(Fig.1b)。在非编码基因表达谱的总体方差中年龄(2.82%)贡献率超过了性别(0.13%)贡献率(Fig.1d)。   Figure 1. Expression profiling of noncoding genes  2.年龄和性别相关非编码基因的差异表达分析  利用Cuffdiff对非编码基因在基因和转录水平进行了分析。统计结果发现,除肾上腺和心脏外雄性大鼠比雌性大鼠共享更多的发育阶段依赖性DEnGs。所有组织中DEnGs的数目从19(雌性大鼠脑)到503(睾丸)不等(Fig.2a)。肾上腺、心、肾、肝、肌肉和胸腺表现出相当数量的发育阶段依赖性DEnGs,脑和肺中DEnGs的数量最少。 性别相关的DEnGs不仅取决于器官,还与年龄相关。脾脏中性别相关的DEnGs数量最多的,而肺中最少,在所有发育阶段中肾上腺和胸腺显示相当一致的DEnGs数量。在幼鼠的大多数器官中性别特异性非编码基因大量表达,而青春期的大鼠性别特异性的非编码基因表达较少。幼鼠大脑中性别相关DEnGs的数量最多,这可能与发育早期大脑快速的发育速度有关(Fig.2b)。   Figure 2. Identification of differentially expressed noncoding genes  3.脑和睾丸中有大量非编码基因表达  当比较不同器官对时,DEnGs的数量有了很大的变化。四个发育阶段中脑和肝脏与其他器官相比时获得了相对较多的DEnGs。睾丸和胸腺中DEnGs的数量表现出明显的年龄依赖性。与其他器官相比,第6和21周的大鼠睾丸中存在最大数量的DEnGs(Fig. 2c)。 4.共表达网络的构建 为了注释大鼠非编码基因功能,作者构建了蛋白编码基因和非编码基因之间的共表达网络,包含3572个与年龄相关的蛋白质编码和非编码基因,1603性别相关基因,和16346个器官相关的基因。并通过GO分析检测共表达分析模块是否富集在特定的生物学过程中。 5.年龄相关的基因共表达模块与细胞分裂、细胞周期和免疫系统发育有关 在与年龄相关的基因共表达网络中,发现了包含3572个基因的14个稳定模块(Fig. 3c)。蓝色的模块包含1151个基因(其中有60个非编码基因)被显著富集到诸如细胞周期过程,细胞分裂,有丝分裂,以及转录调节和RNA代谢调节GO条目中。这些条目富集结果说明发育差异与生长发育过程中的代谢变化和基因表达调控有关。通路分析显示细胞周期和碱基切除修复相关基因被显著富集,提示细胞周期和自我修复功能可能受老化影响。其他模块如棕色和绿色显示出另一个免疫系统相关的富集趋势,如免疫反应、免疫系统发育和淋巴器官发育。很多脑、脾脏和胸腺中的年龄相关基因与癌症和其他年龄相关疾病关联,这提示衰老可能是通过影响免疫系统导致这些疾病的发生。其他基因主要涉及帮助免疫系统抵御炎症和转移白细胞以建立机体的防御系统。最后,粉红色模块中的七个非编码基因与骨骼系统的发育有关。   Figure 3. Co-expression network construction on age-related genes. 本文还利用相同的方法构建了器官相关和性别相关基因的共表达网络,结果显示器官相关模块很大程度上取决于不同组织类型的功能,性别相关模块中包含性别发育相关基因。 6.年龄相关棕色模块的可视化分析显示枢纽编码基因在网络中的调节作用 作者通过关联3,572个年龄相关基因中的特征向量基因研究模块和年龄之间的关系(Fig.4a),毗邻关系反应模块的相关性。包含许多非编码基因的棕色模块与年龄有相对紧密的关系。因此选取了此模块中189个与衰老相关的基因(包括七个非编码基因,阈值为0.32)进行进一步的网络可视化分析,获得了两个主要的集群,其中有几个中心基因连接着相邻基因。虽然非编码基因不在网络的中心,但是七个大鼠的非编码基因与免疫系统相关基因共同参与网络运作。   Figure 4. Network visualization of age-related brown module. 结论:利用大鼠bodymap RNA-seq数据构建了大鼠4个发育阶段、11个组织中的3,458个非编码基因的表达谱。构建了一个推断蛋白质非编码基因生物学功能的编码和非编码基因共表达网络,年龄相关模块被富集到免疫系统发育相关条目。年龄相关棕色模块的可视化分析发现大鼠非编码基因与免疫系统相关基因共同参与网络运作。 创新点:本文提供了一个鉴定和注释大鼠非编码基因的模型,涉及到多个器官和雌雄两性的不同发育阶段。建立了一个全面、可靠的推断多个器官之间随发育变化的非编码基因表达平台,为以后大鼠中非编码基因表达谱研究奠定了基础。...

PMID: 27922056 杂志:Scientific reports 影响因子:5.228   研究背景:随着高通量RNA-seq技术的发展,已经在许多物种中鉴定出了大量的基因间长链非编码RNA(lincRNAs)。有研究表明,一些lincRNA在植入前胚胎发育(PED)过程中发挥重要作用。猪是一种理想的生殖和生物医学应用研究模型,然而对猪lincRNAs的研究还比较欠缺,因此需要对lincRNAs进行全面的全基因组范围鉴定。此外,合子基因组激活(ZGA)对成功的移植前胚胎发育至关重要,因此需要对ZGA的具体分子机制进行研究。目前很少有研究报道猪PED中转录组的变化情况,对PED中lincRNAs的功能研究还很有限。 公共数据获取: 从NCBI-SRA数据库中下载得到五个猪RNA-Seq数据集,Supplementary Table S1中列出了RNA-seq数据编号和详细信息。 Supplementary Table S1 Details of RNA-seq data 技术路线: 实验结果: 1.基于猪RNA-seq数据集的lincRNAs鉴定 本文利用5个包含猪各种组织或细胞的RNA-seq数据(Supplementary Table S1)对linckRNAs进行了全面鉴定。经reads mapping和转录本组装后从122,007个基因座鉴定出了195,531个转录本。排除已知mRNA并进一步筛选后获得了7,618个lincRNA。 2.猪lincRNA的结构特点 作者对预测获得的lincRNAs和Ensemble中记录的mRNAs进行了比较,发现lincRNAs中的外显子明显较少(平均值:lincRNAs 2.97个、mRNAs 8.49 个; Kolomogorv-Smirnov Test, P-value<2.2×10−16)(Fig. 2A)。而猪lincRNAs外显子长度比蛋白编码基因长(平均值:lincRNAs 484bp、mRNAs 307bp; Kolomogorv- Smirnov Test,P-value<2.2×10−16)(Fig. 2B)。由于较少的外显子数量,整体lincRNA长度小于蛋白编码基因的转录本长度(平均值:lincRNAs 1338 bp、mRNAs 2842 bp;Kolomogorv-Smirnov Test,P-value<2.2×10−16) (Fig. 2C)。 Figure 2. Features of pig lincRNAs.         3.猪lincRNAs的低表达量和组织特异性         对不同组织和细胞系中lincRNAs的表达模式分析结果显示lincRNAs与蛋白编码基因相比表达量较低。为了定量评估每个转录本的表达特异性,作者应用依赖于Jensen-Shannon(JS)距离算法的基于熵度量法计算每个转录本的表达特异性。结果显示,lincRNAs比蛋白编码基因表现出更高的JS平均值(Fig. 3B),这说明lincRNAs比蛋白编码基因有更高的组织特异性。 Figure 3. Characteristics of pig lincRNAs expression.         4.lincRNAs与邻近蛋白质编码基因之间潜在的顺式作用关系         研究表明,lincRNAs可能通过正、负两种方式调节邻近蛋白编码基因表达。通过GO分析发现猪lincRNAs的邻近蛋白编码基因被富集到“转录调控”功能。对lincRNA与邻近蛋白编码基因的转录起始位点(TSSs)距离的分析发现了462个TSSs距离在4kb以内的lincRNA:mRNA对。值得注意的是lincRNA:mRNA对中32%的lincRNAs始于400nt内,而mRNA:mRNA对只有12%(Fig. 3D)。这些结果说明猪的lincRNAs可以顺式调节他们邻近蛋白编码基因的表达。 5.植入前胚胎发育相关lincRNAs的功能分析 过滤除去每个胚胎发育阶段的低方差lincRNAs和mRNAs后,进行了共表达网络分析(WGCNA)探索猪PED过程中lincRNA的作用。通过无监督聚类分析鉴定出了23个共表达模块(Fig. 4A)。其中5个模块显示发育阶段特异性(Fig. 4B),它们可能代表每一个过渡阶段的核心基因网络。为了进一步预测lincRNAs在猪PED过程中发挥的功能,作者对每个阶段特异性模块进行了GO富集分析,发现对应ZGA的4细胞到8细胞转变阶段的模块被富集到转录调控、表观调控和细胞周期条目中(Fig. 4C)。 Figure 4. Function prediction of PED associated lincRNAs.         6.猪植入前胚胎发育枢纽 linckRNA的鉴定         为了鉴定猪PED中的枢纽linckRNA,作者利用WGCNA测量了模块内的基因间连接,并提取了每个阶段特异性模块中的前100个枢纽基因。然后在4细胞阶段特异性模块中的枢纽基因集中选取10个lincRNAs进行了qRT-PCR分析,发现这些lincRNAs在生殖组织中作为一个整体表达(Fig. 5A)。研究还发现在卵巢中高表达的两个lincRNAs:tcons_00166370和tcons_00020255 在4细胞阶段显示出明显的激活趋势,而8细胞阶段迅速下调(Fig. 5B)。尽管这些参与猪PED过程的lincRNAs的作用机制还不清楚,枢纽lincRNAs的鉴定为进一步的功能研究提供了宝贵的资源。 Figure 5. The expression of two hub lincRNAs from 4-cell stage-specific module in different tissues and PED. 结论:进行了完整的猪lincRNAs分析,提供了首个猪植入前胚胎发育相关lincRNAs图谱。WGCNA分析显示PED相关lincRNAs与细胞周期调节、转录和表观调控过程有关。对枢纽lincRNAs的qRT-PCR分析发现了两个与PED密切相关的lincRNA:TCONS_00166370 和TCONS_00020255。...

Populus simonii × Populus nigra WRKY70 is involved in salt stress and leaf blight disease responses 小黑杨WRKY70基因在盐胁迫和叶枯病响应中的作用 杂志:Tree Physiology 影响因子:3.653 PMID: 28369503 研究背景: WRKY超家族是重要的植物转录因子(TF)家族成员,其DNA结合域有保守的N端WRKYGQK七肽。WRKY蛋白可特异性识别结合靶基因启动子的顺式元件(CE),w-box(TTGACC/T)。过去20多年的研究表明WRKY是多种生物学过程(如种子休眠/萌发、衰老、发育和生物/非生物胁迫响应)信号网络的关键节点。WRKY蛋白通常会激活或抑制植物的转录调控过程,一些WRKYs甚至同时具有激活和抑制作用。一种WRKY 转录子也可调节几个不同生物学过程。 植物常受到各种生物/非生物胁迫。盐和病原体胁迫是常见的环境刺激,盐胁迫会影响离子渗透压平衡,排毒及生长调节过程。菌类胁迫会使植株产生叶斑,腐烂和枯萎。植物进化出精细响应调节机制来适应这些胁迫,许多TFs是生物/非生物胁迫信号响应网络中重要的调控点。WRKY蛋白作为一种重要的胁迫响应TFs,参与了广泛的生物和非生物胁迫响应过程。 小黑杨在中国北方分布广,这种杂交白杨生长迅速,能很好地适应高盐,寒冷,干旱和贫瘠的环境,因此是一种研究木本植物胁迫响应机制的理想材料。我们既往转录组分析结果表明,在小黑杨受到链格孢侵染或在盐碱、干旱和重金属胁迫下PsnWRKY70基因的表达量发生显著变化。我们推测PsnWRKY70基因可能在小黑杨生物/非生物胁迫响应调控网络中发挥重要作用。既往在WRKY蛋白的生物功能方面的研究进展较多,但关于调控机制的阐述有限。因此进一步研究PsnWRKY70转录子在小黑杨胁迫响应调控网络中的作用具有重要意义。 材料和方法 材料:小黑杨 培养条件: 盐胁迫实验:在25-32℃温室,自然光照条件下,140mM的NaCl溶液处理 叶枯病胁迫实验:条件为:白天/晚上气温,25℃/20℃;湿度,50-60%;光周期,16小时光/8小时黑暗;光合光子通量,150 μmol m-2 s-1。 处理组: .盐胁迫实验组:2个月月龄的NT,OEX和REX植株每隔三天用140mM的NaCl溶液处理。 叶枯病胁迫实验组:2个月月龄的NT,OEX和REX植株喷洒链格孢菌孢子悬液。在处理前(0 h)和处理后36 h收集第三至第五功能叶片用于提取RNA。分别在0天,处理后3、6、9、12天收集第六到第八个功能叶用于MDA含量测定。 对照组:用水处理,所有样本三个重复。 转录组分析:在叶枯病抗性分析培养条件下培养的NT、OEX1和REX1的植株,长到30厘米后用140 mM的NaCl溶液处理。收集盐胁迫36小时后的第五个功能叶(两个重复) 测序平台:百迈客高通量测序平台Illumina HiSeq 4000 分析平台:百迈客云平台(BMKCloud)主流程和小工具 方法: 本文拟研究小黑杨的生物/非生物胁迫响应调节网络。进行了下列实验: 启动子克隆及序列分析:为全面了解PsnWRKY70基因的生物学功能,对PsnWRKY70启动子进行克隆,并对启动子CEs进行了生信分析,预测了PsnWRKY70的转录起始位点(TSS)并进行PCR验证。 2.酵母单杂交筛选和验证:进行了酵母单杂交筛选来研究PsnWRKY70基因的上游调控子,并对PsnWRKY70,PsnMYB,PsnNAM和PsnGT1蛋白质与PsnWRKY70基因启动子互作关系进行分析。 3.PsnWRKY70基因序列和表达分析:对PsnWRKY70基因开放阅读框和保守域进行预测,确定了PsnWRKY70 TF的物理化学参数,预测了亚细胞定位。并与TAIR和RGAP数据库部分拟南芥和粳稻的Group III WRKY TFs序列进行多重序列比对(ClustalW)构建得到不同物种32种WRKY蛋白的系统进化树(MEGAver.6.0)。 4.基因克隆、遗传转化和验证:克隆了PsnWRKY70的开放阅读框架(ORF)并融合到绿色荧光蛋白(GFP)中,OEX和REX载体通过农杆菌介导的叶片转换法将重组子转移到小黑杨中。并进行了PCR、Northern blot、表达量水平的验证。 5.胁迫分析:根据表型、损伤指数、丙二醛(MDA)含量和基因表达模式对转基因和非转基因(NT)组的盐胁迫耐力和叶枯萎病抗性进行评价和比较。 6.转录组分析:为进一步确定了PsnWRKY70 转录子的盐胁迫反应调节机制,选择盐胁迫处理的转基因和NT叶片作为样本进行转录组测序和分析。 研究结果: 1.启动子分析和酵母单杂交实验 克隆了2471bp的PsnWRKY70基因的启动子序列,分析显示提示许多胁迫响应CEs存在于PsnWRKY70的启动子区域,这些CEs中,W-box(TGAC)和GT1元素(GAAAAA)是高度富集的,酵母单杂交筛选结果显示,有五个基因(PsnBTB/POZ、PsnCCD1、PsnZFP、PsnWRKY70、PsnFP)可与W-box及其相邻序列结合,同时七个基因产物(PsnNAM、PsnDDS1、PsnMYB、PsnLHTP、PsnGT1、PsnETIF6-2、PsnAPD)可与GT1元件和其邻近序列结合。 为进一步证实PsnWRKY70 /PsnMYB / PsnNAM /PsnGT1蛋白与相应CEs的互作关系,将报道载体(pCAM-Wr/Wm/Gr/Gm) 和效应载体(pROKII-W70/MYB/GT1/NAM)共转移到烟草叶片中,GUS/LUC相对活性实验表明:在盐胁迫条件下PsnWRKY70可特异性结合W-box,而PsnMYB、PsnGT1、PsnNAM可特异性结合GT1元素。   2.PsnWRKY70基因序列分析和表达分析 PsnWRKY70的ORF长度为966bp,编码321个氨基酸的蛋白质。单WRKY域和Cx7Cx23HxC-type锌指状模体表明PsnWRKY70 TF是Group III成员。PsnWRKY70蛋白化学式可能的是C1553H2405N445O513S16,理论pI 为5.72,分子量为36.03 kDa。亚细胞定位显示PsnWRKY70存在于细胞核的可能性最大。多序列比对结果显示PsnWRKY70与拟南芥和粳稻的Group III WRKY TFs一致(图1)。系统发育分析结果表明PsnWRKY70和胡杨WRKY70具有高同源性(XP_011001689.1)(图2)。qRT-PCR 检测PsnWRKY70在小黑杨不同组织种表达水平不同,在叶中高表达,根和茎中低表达,因此选择叶片作为材料进行后续实验。 图1多重序列比对(红盒框内序列为保守WRKY域,蓝框内氨基酸残基为锌指模体。) 图2系统发育分析:来自不同物种的WRKY蛋白质系统发育树,红色标识的蛋白质为PsnWRKY70 TF 3.PsnWRKY70 转基因植株的培育和验证 为进一步研究PsnWRKY70 基因在不同胁迫中的生物学功能,通过转基因实验,构建小黑杨PsnWRKY70基因过表达和抑制表达的转基因植株,并在转基因和NT植株中进行了胁迫响应分析。得到了8个OEX植株和10个REX植株并通过gDNA PCR、Northern blot、基因表达水平结果进行了验证。 4.转基因植株和NT植株的盐胁迫和叶枯病胁迫响应 数据显示在正常生长条件下REX植株(REX1-REX3)一般都比OEX(OEX1-OEX3)和NT植株高(表1和2)。 在盐胁迫下,REX植株的RHGRs明显大于NT和OEX。此外,在所有盐胁迫处理的植株中,REX1有最大的RHGR(0.296±0.008),而OEX2是最小的RHGR(0.199±0.011)(表1)。在病菌胁迫下,REX往往比NT和OEX生长慢。OEX3的RHGR最大(0.264±0.019)REX1的RHGR最小(0.154±0.012)。(表2)。 表1盐胁迫下的OEX、REX和NT植株的HG 表2叶枯病胁迫下OEX、REX和NT植株的HG 叶盐损伤指数表明,OEX比NT和REX损伤更大。而叶病指数表明,REX比NT和OEX叶疾病症状更严重。此外,REX2叶盐害指数最小(52.06%±1.34%),OEX2叶枯病指数最小(27.30%±1.50%)(图3a-d)。 图3...

Genome-Wide Analysis Reveals Extensive Changes in LncRNAs during Skeletal Muscle Development in Hu Sheep 湖羊骨骼肌发育过程中全基因组范围LncRNAs的显著变化   杂志: genes  影响因子:3.600 PMID: 28763026       研究背景: 羊肉具有蛋白含量高、脂肪和胆固醇含量低等优点,促进羊的肌肉生长可提高羊肉产量。过去关于羊骨骼肌生长的研究主要集中在蛋白质编码基因,然而基因组绝大部分是非编码序列。长非编码RNA(lncRNAs)是一种重要的非编码RNA,越来越多研究发现某些功能型的lncRNAs是新的肌肉调节元件,发挥重要作用。关于羊肌肉相关lncRNA的转录组学研究较少,尤其关于湖羊的研究更少, lncRNA在羊骨骼肌生长过程中的表达类型和潜在作用大部分都是未知的,因此了解羊不同生长时期肌肉转录组的动态变化具有重要意义。 本文拟研究湖羊三个关键生长阶段(110天胎儿期,5天幼年期,2岁成年期)肌肉lncRNA的表达模式和潜在作用,筛选差异表达lncRNA的和DEGs(差异表达基因)的靶基因。同时通过lncRNA-gene网络预测湖羊肌肉生长的lncRNA潜在调控因子,获得湖羊肌纤维生长相关的转录水平的候选调节因子。 材料和方法 材料:相同的自然光环境下饲养的胎儿期、幼年期、成年期湖羊,每个时期选取3个随机样本,取既定部位(12和13胸椎之间)的LD肌肉样本,采样后即刻液氮冷冻提取RNA。 测序平台:Illumina platform 分析平台:百迈客云平台(BMKCloud),分析内容如下: 在百迈客云平台上,对胎儿期、幼年期、成年期湖羊肌肉细胞进行RNA-seq测序后转录组拼接。进行注释后,先排除<200个核苷酸或单外显子的转录子,再用CPC,CNCI,PFAM,CPAT等工具从未知转录组中筛选候选lncRNA。四种方法FPKM>0.1的转录子交集定义为lncRNA转录子。 应用DEGseq packages (1.10.1) 来分析组间的表达差异,FDR值<5%,log2(倍数变化)的绝对值被定义为差异化表达。 预测差异表达的lncRNA的顺式靶基因和反式靶基因。 为分析lncRNA的主要功能,通过NCBI的Nr、GO、KEGG、COG数据库比对进行靶基因和DEGs注释,KS≤0.05,信号通路矫正p值≤0.05的GO term被定义为显著富集的。 为进一步研究lncRNA和他们的靶基因的相互作用,建立LncRNA-Gene共表达网络。 结果: 1.测序拼接和转录组分析 胎儿期、幼年期、成年期3组RNA-seq序列质控后,经过去接头、多聚尾、低质量序列后,每组平均获得了65578070,65591958,71241551的拼接序列,9个文库平均GC含量为54.39%,每个样本Q30值≥91.71%, 92%以上与O. aries参考基因组特异性匹配,分析显示胎儿期有45.1%的序列与外显子区域匹配,后期阶段匹配度更高(幼年期53.8%、成年期53.7%),在幼年、成年期组的内含子和基因间序列比例低于胎儿期。(表1) 表1.矫正后序列与不同阶段湖羊参考基因组比对 2.lncRNA筛选和特征性描述 为研究湖羊肌肉lncRNA的基本特征,筛选lncRNA并与mRNA比对。CPC、CNCI、PFKM、CPAT交集部分有6924个lncRNA转录子,包括已知的保守lncRNA,肌肉分化相关的lncMD(图1A) 图1 A 韦恩图  图1B. lncRNA和mRNA在每个染色体上的分布比例。红色和黑色线条分布代表lncRNA和mRNA,蓝色线条代表相应染色体在基因组中的大小比例 lncRNA转录子分为4606个lincRNA(66.5%),1131个内含子lncRNA(16.3%),1187个反义lncRNA(17.1%)。与mRNA类似,lncRNA转录子在26对染色体和X染色体中分布广泛,但线粒体中不存在。而且lncRNA在几个染色体中的比例与染色体大小比例一致,尤其是18号染色体,表明在此研究中相应lncRNA可能体现重要功能(图1B) 比较lncRNA和mRNA的外显子特征,结果显示大部分lncRNA每个转录子包含2-5个外显子(均值3.3),比mRNA少(均值7.9,图1C) 图1C 湖羊lncRNA每个转录子外显子数      图1D 湖羊lncRNA外显子大小分布 另外大部分lncRNA包含2个外显子,而包含2个外显子的mRNA仅占比3.9%,明显低于lncRNA。lncRNA中外显子平均长度相对长于mRNA,大部分小于200bp(图1D)。与蛋白编码基因一致,在肌肉生长过程中同一阶段lncRNA表达趋势相似,且平均表达水平比与蛋白编码基因低(图2A,B) 每组重复间的相关性分析显示相关性高(图3A-C),而且在6924个表达的lncRNA转录子中,于某一生长阶段特异性表达的占比33.03%,这个比例在蛋白编码基因中较低(4%),提示lncRNA的特殊意义和动态特性。胎儿期特异性lncRNA为1042个,远高于幼年期(626)和成年期(619),表明lncRNA在早期发展阶段的重要意义。 图2A胎儿期、幼年期、成年期湖羊肌肉lncRNA的FPKM分布 图2B胎儿期、幼年期、成年期湖羊肌肉蛋白编码基因的FPKM分布 图3 每组重复间的相关系数分析(A胎儿期组,B幼年期组,C成年期组) 3.差异表达分析及靶点基因预测 3个时期两两比较分析显示在胎儿期vs幼年期、幼年期vs成年期、胎儿期vs成年期(对照组vs实验组),分别有27、14、92个lncRNA,239 270 1437个基因是特异性表达的。(|log2FC| > 1, FDR < 0.05).值得一提的是,幼年期vs成年期组差异表达的lncRNA量最低,在胎儿期vs幼年期组和幼年期vs成年期组,DEGs的数量几乎一样多,表明产前和产后尽管在时间只相差1一个月,但是转录水平的差异较大(图4A-D)。 图4 对比组差异表达lncRNA和基因的数量(A 不同对比组差异表达lncRNA数量的韦恩图 B 不同对比组DEGs数量的韦恩图C不同对比组差异表达lncRNA总数 D不同对比组DEGs总数) 差异表达的lncRNA中,在胎儿期vs幼年期有36个上调lncRNA,42个下调lncRNA,幼年期vs成年期有13个上调lncRNA,28个下调lncRNA,胎儿期vs成年期有68个上调lncRNA,78个下调lncRNA。DEGs中,胎儿期vs幼年期组有1028个上调基因和487个下调基因、幼年期vs成年期组有659个上调基因和900个下调基因、胎儿期vs成年期有1862个上调基因和1749个下调基因。差异表达的lncRNA和DEGs的分层集群显示幼年期和成年期的表达模式相似而与胎儿期有所差异(图4E,F)。 图4 E 差异表达的lncRNA的分层集群  F DEGs的分层集群 为进一步评估RNA测序的结果,选择MYOG(从胎儿期富集的与晚期肌肉细胞分化相关的基因),MYH7(肌肉结构基因),5种差异表达的lncRNA,4种DEGs进行qRT-PCR分析。表达量与RNA-Seq结果一致。结果表明表达与测序结果有较好相关性,表明测序结果可行度高。 lncRNA可以通过与靶基因顺式和反式作用发挥功能,通过两两对比分析,预测相邻上下游100kb的和或差异表达lncRNA的互补蛋白编码基因。得到共201个靶基因。 图5 qRT-PCR和RNA-Seq分别验证不同时期湖羊肌肉差异表达lncRNA和基因的表达水平 4.差异表达的lncRNA和mRNA靶基因的生信分析 为进一步研究差异表达的lncRNA,通过与NR / GO/...