12月04 【成功案例】不同肌内脂肪含量的两种牛中肝脏转录组研究

The comprehensive liver transcriptome of two cattle breeds with different intramuscular fat content

不同肌内脂肪含量的两种牛中肝脏转录组研究

发表杂志：Biochemical and Biophysical Research Communications

影响因子：2.466

PMID：28669724

 

摘要

肌内脂肪（IMF）含量是牛肉质量的重要决定因素。晋南牛和西门塔尔牛之间的IMF含量有显着差异。在这里，为了鉴定与IMF沉积有关的候选基因和网络，研究人员深入探索了这两种牛中肝脏的转录组结构。研究人员对5个晋南牛和3个西门塔尔牛的肝脏进行转录组测序，产生了约4139M reads。共检测到124个差异表达基因（DEGs），在晋南牛肉中，有53个上调，71个下调。 此外，共鉴定了1282个潜在的新基因。GO分析显示，这些DEGs（包括CYP21A2，PC，ACACB，APOA1和FADS2）在脂质生物合成过程、胆固醇酯化调节、胆固醇逆向转运和脂蛋白脂肪酶活性的调节中显着富集。参与丙酮酸代谢途径的基因也显著过表达。此外，本研究还确定了一个与脂质代谢有关的相互作用网络，这可能是导致牛在基因组中沉积的原因。由此推论，参与调节脂质代谢的DEGs可能在IMF沉积中起重要作用。综上所述，研究者提出了一组候选基因和相互作用网络，可以与IMF沉积相关联，并用作牛的育种中的生物标志物。

 

背景

牛肉是人类食物最重要的蛋白质来源之一。在不同品种的牛之间，生长速度，肌肉质量和肉质存在显着差异。津南黄牛是我国五大黄牛品种之一，以其肉质鲜嫩，纹路鲜明而闻名。相比之下，源自瑞士的西门塔尔牛是世界上大量喂养的品种，主要用于生产好的乳品或肉质的品种，它们的生长速度较快，瘦肉含量高，以至于肌内脂肪（IMF）含量以及嫩度低于晋南牛肉。 IMF含量和肌肉纤维特性是肉品质的主要决定因素，包括感官特性（嫩度，多汁性和风味）和营养价值。IMF含量与牛肉感官品质性状呈正相关。西门塔尔牛和晋南牛的IMF含量差异使其成为比较基因组学研究的重要材料，用来研究牛肌内脂肪酸沉积的分子机制。

肝脏与脂肪组织和骨骼肌是哺乳动物脂质代谢和其他代谢过程中最重要的器官之一。它是非酯化脂肪酸吸收、氧化和代谢转化的中心器官。此外，它具有从头脂肪生成，细胞质三酰甘油储存，从葡萄糖和其他非脂质前体合成脂肪酸的酶活性。随着高通量测序技术的发展，已有对猪和乳鸽肝脏进行转录组研究，以探索影响IMF成分的潜在候选基因。日本黑色longissimus dorsi和荷斯坦黑白花牛转录组报告显示，在日本黑牛中，具有较强IMF沉积能力特征的差异表达基因中，大多数表达上调。并且鉴定了一个与细胞形态和脂质代谢相关的基因网络。然而，并没有两种不同IMF水平的牛肝脏比较转录组学研究。

在该研究中，使用RNA-Seq方法来分析西门塔尔牛和津南牛的肝脏转录组数据。这项研究的主要目标是确定差异表达的基因和相互作用网络，这可能有助于牛的肌内脂肪酸组成研究。 另外，该研究鉴定的候选基因可能会对牛的分子育种有帮助。

 

材料和方法

为了消除性别差异，该研究全部选择雄性牛。3头西门塔尔和5头晋南牛，生长1.5年，屠杀后30分钟内取肝脏组织，在液氮中快速储存，提取总RNA。

测序平台：北京百迈客生物科技有限公司Illumina Hiseq 3000平台，PE150

分析平台：百迈客云科技有限公司（BMKCloud）

分析内容：1.低质量reads质控；

2.参考基因组比对（Bos taurus参考基因组，版本UMD 3.1.1）；

3.基因表达量和差异表达分析；

4.差异表达基因的功能富集分析；

5.蛋白质互作分析；

 

结果

1.西门塔尔牛和晋南牛肝组织RNA测序结果

使用Illumina Hiseq 3000平台对西门塔尔（n = 3）和晋南（n = 5）牛的肝进行转录组测序。质控后共获得61.33 Gb数据，约为牛基因组的23倍。8个样本的Q30均大于93％。与参考基因组比对率均在80.27％-85.48％范围内（表1）。

表1.RNA测序数据和比对结果统计

2.新基因的鉴定和注释

利用Cufflinks软件来鉴定西门塔尔牛和晋南牛的新基因。该研究中共检测到1282个潜在的新基因。 其中，有1043个基因通过与数据库（NR，Swiss-Prot，GO，COG，KOG，Pfam和KEGG）比对进行了注释。 值得关注的是，在Swiss-Prot蛋白质数据库中可以注释到364个新基因，这意味着它们是潜在的蛋白质编码基因，在之前的牛参考基因组中没有注释。 此外， GO和KEGG数据库中分别注释548和371个新基因。

3.差异基因表达分析

使用DESeq R软件包鉴定西门塔尔牛与晋南牛的差异表达基因（DEGs）。将Fold Change≥2且FDR<0.05作为筛选标准，共鉴定了124个显着的DEGs，其中晋南牛中有53个（42.7％）上调，71个（57.3％）下调（图2）。西门塔尔牛和晋南牛中17个新基因有显著差异。一些转录本在丰度上有很大的差异，如ENSBTAG00000047322（|log2-fold change| = 7.16），血红蛋白亚基beta（HBB，|log2-fold change|= 3.76）和超氧化物歧化酶1（SOD1，|log2-fold change |= 8.38）它们被认为与肌内脂肪酸组成相关的候选基因。

图1.两种牛中124个差异表达基因热图

4.差异表达基因功能富集分析

为了深入了解西门塔尔牛和晋南牛肝中差异表达基因的生物学关系，研究人员将差异表达基因进行GO，KEGG富集分析。结果显示， GO生物学过程中显著富集了23个terms，主要包括催化活性（GO：0043086），脂质生物合成过程（GO：0008610），胆固醇酯化调节（GO：0010872）， 逆转胆固醇转运（GO：0043691）和脂蛋白脂肪酶活性的调节（GO：0051004）的负调节(P < 0.05）。 共有4个KEGG通路被显著富集（P <0.05），主要包括造血细胞谱系（bta04640），细胞粘附分子（CAMs，bta04514），丙酮酸代谢（bta00620）和T细胞受体信号传导通路（bta04660）（图2）。

图2.两种牛的差异表达基因GO富集中前20个显著富集的terms和KEGG通路分析

5.蛋白质相互作用分析

为了解西门塔尔牛和晋南牛肝脏中DEGs的相互作用，研究人员利用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件进行了蛋白质 – 蛋白质互作网络分析。共鉴定了9个网络， 有趣的是，第二个网络与脂质代谢，分子运输和小分子生物化学相关，该网络包括乙酰辅酶A羧化酶β（ACACB），载脂蛋白A1（APOA1），脂肪酸去饱和酶 2（FADS2）和其他脂代谢相关基因（图3）。

图3.两种牛中差异表达基因的蛋白-蛋白互作网络图

结论

综上所述，该研究系统地比较了晋南牛和西门塔尔牛的肝脏转录组差异。 总共有124个被识别出来。 与这两个品种的IMF沉积差异一致，这些DEGs在脂质生物合成和代谢相关的生物过程和途径中富集。 与脂质代谢有关的相互作用网络也被确定。 总的来说，该研究提供了与IMF沉积有关的潜在的候选基因和调控网络，这对于产生更好的肉质的牛饲养是有用的。

 

创新点

在前期的报告中有较强IMF沉积能力特征的牛转录组研究，但是并没有两种不同IMF水平的牛转录组学研究。该研究中，使用RNA-Seq方法来分析两种不同IMF水平的牛肝脏转录组数据。鉴定了差异表达的基因和相互作用网络，这一结果为牛的肌内脂肪酸组成研究奠定了基础。此外，该研究鉴定的候选基因可能会对牛的分子育种有帮助。

 

参考文献

Xi W, Zhang Y, Zhang X, et al. The comprehensive liver transcriptome of two cattle breeds with different intramuscular fat content[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017:1018-1025.