公共数据揭示小麦Bax抑制剂-1蛋白(BI-1)与水通道蛋白TaPIP1相互作用增强拟南芥抗病性

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摘要
Bax抑制剂-1(BI-1)是真核生物中进化保守的内质网(ER),定位细胞死亡抑制因子。 BI-1抑制生物和非生物胁迫的能力在拟南芥中得到了充分研究,而小麦中BI-1的功能在很大程度上是未知的。在这项研究中,将禾谷镰刀菌(Fg)处理的小麦进行RNA-seq分析,然后分离小麦BI-1基因TaBI-1.1。通过水杨酸(SA)处理诱导TaBI-1.1表达,并通过脱落酸(ABA)处理诱导TaBI-1.1的下调。基于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色,TaBI-1.1在成熟叶和根中表达,但不在下胚轴或幼叶中表达。 TaBI-1.1在拟南芥中的组成型表达增强了其对丁香假单胞菌病毒(Pst)DC3000感染的抗性并诱导SA相关基因表达。此外,TaBI-1.1转基因拟南芥显示出由高浓度SA引起的损害的减轻,并降低了对ABA的敏感性。与表型一致,35S :: TaBI-1.1和Col-0植物的RNA-seq分析显示TaBI-1.1参与生物胁迫。这些结果表明,TaBI-1.1正向调节SA信号并在对生物胁迫的响应中起重要作用。此外,TaBI-1.1与水通道蛋白TaPIP1相互作用,并且它们都定位于ER膜(内质网膜)。此外,研究人员证明了SA处理后TaPIP1上调,并且TaPIP1转基因拟南芥增强了对Pst DC3000感染的抗性。由此表明,在ER膜上TaBI-1.1和TaPIP1之间的相互作用可能发生在对SA信号和防御反应的响应中。

材料和方法

使用拟南芥Columbia-0(Col-0)作为TaBI-1.1过表达的背景, 突变体atbi1-2从拟南芥生物资源中心(ABRC)获得。 从栽培的小麦品种小白麦扩增TaBI-1.1和TaPIP1的cDNA, 将PCR产物克隆到pLB载体中,使用DNAMAN 6.0软件进行氨基酸序列同一性比较。
RNA-Seq Analysis
收集来自4周龄Col-0和转基因系35S :: TaBI-1.1的叶片用于RNA-seq分析,使用HiSeq 2500平台测序。测序数据与TAIR 10拟南芥参考基因组比对。使用TopHat和Cufflink软件包进行mRNAseq数据分析以及DEG的鉴定和分析。通过GOseq软件进行差异表达基因的GO富集分析。根据KEGG数据库通路进行KEGG富集分析,寻找差异表达基因的富集通路。在百迈客云平台(BMKCloud)完成小麦Fg处理的RNA-seq数据下载和分析, SRA数据库(登录号:PRJNA289545)。
其他实验:1.qRT-PCR分析;2.转基因拟南芥植株在胁迫处理下的应答及性状评价;3.β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性测定;4.细菌接种和细菌生长的监测;5.酵母双杂交系统;6.Pull-Down assay(免疫沉淀法);7.亚细胞定位测定;8.ELISA Assay(酶联免疫吸附试验)

分析结果
1.通过qRT-PCR和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色确定TaBI-1.1的表达模式
研究人员分析了来自Fg处理的小麦RNA-seq数据,以研究植物防御信号通路。从RNA-seq分析中分离出前10个差异表达基因。在这10个基因中鉴定了两个小麦BI-1基因:TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980。 TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980在之前的研究中被命名为TaBI-1。在小麦Ensembl数据库中仅筛选出三种BI-1基因:TaBI-1,TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_488014_AA1573990。在两个差异表达的BI-1基因中, TaBI-1.1的差异最大。根据氨基酸比对,TaBI-1.1与TaBI-1同一性达到99.19%。与对照相比,Fg处理对TaBI-1.1的表达水平上调24倍。许多关于AtBI-1的研究已经证实AtBI-1在植物中对生物和非生物胁迫的抗性中起关键作用。 TaBI-1.1蛋白的序列与AtBI-1有69.88%的同一性,表明该序列在BI-1家族中基本保守。使用qRT-PCR监测TaBI-1.1的表达模式以确定TaBI-1.1在生物和非生物胁迫中可能的作用。TaBI-1.1的表达在响应SA处理时显着上调,在响应ABA处理时下调。 SA处理48小时后TaBI-1.1表达达到8倍高峰(图1A)。 响应ABA处理的下调水平在8小时达到初始水平的约1/5(图1C)。 响应NaCl处理,表达水平在4小时后下降,在2小时稍微增加并且在8小时后回到其初始水平(图1B)。
研究者创建了含有1.7kb TaBI-1.1启动子并生成转基因拟南芥的PBI :: GUS融合构建体,以研究TaBI-1.1的空间表达模式。使用GUS染色测定组织GUS活性。在成熟叶和根中有TaBI-1.1表达,但在下胚轴和幼叶中观察不到(图1D)。还检测了各种小麦组织中的TaBI-1.1表达水平,包括根,茎,叶和小穗,结果表明TaBI-1.1的表达在这些小麦组织中普遍存在,而且在叶中最高,在小穗中最低(图1I)。在SA和NaCl处理之后,成熟叶中的表达与对照相比增加,并且SA处理的表达更高。当SA和NaCl处理时,在下胚轴中也检测到表达(图1E,F)。在ABA处理的植物的叶子中检测到较弱的表达(图1G)。通过qRT-PCR进一步证实GUS表达水平(图1H)。以上结果表明,TaBI-1.1在各种胁迫下均有表达。

图1. 通过qRT-PCR和GUS染色评估TaBI-1.1的相应表达模式

2.TaBI-1.1的表达增强了拟南芥对Pst DC3000感染的抗性
经过Fg和SA处理后表达上调,假设TaBI-1.1可能参与生物胁迫反应。研究人员在拟南芥中异位表达TaBI-1.1,在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的控制下验证这一假设。选择两个TaBI-1.1表达水平相对较高的纯合株系3和7(35S :: TaBI-1.1#1和35S :: TaBI-1.1#2)用于进一步分析(图2A)。将atbi1-2,Col-0和两个转基因品系的四周龄叶子进行Pst DC3000感染或10mM MgCl 2处理(模拟物)。在模拟实验中,在用10mM MgCl 2处理3天后,在atbi1-2,Col-0和两个转基因品系的叶中没有观察到明显差异(图2B)。在用600nm(OD600)0.002的光密度接种Pst DC3000,3天后在这些叶中检测到疾病症状。 atbi1-2突变体表现出的症状较严重,因为几乎所有的叶片都表现出严重的萎黄和坏死,而两种转基因品系表现出比atbi1-2和Col-0更轻微的疾病症状。转基因植物的一小部分叶子是绿色的,没有表现出萎黄和坏死。 Col-0叶中疾病症状的程度介于atbi1-2和两个转基因品系之间(图2C)。在接种Pst DC3000或10mM MgCl 2(模拟物)后24小时监测SA水平。在模拟组中,在35S :: TaBI-1.1#1中观察到最高的SA水平,且显着高于Col-0。在Pst DC3000处理下,与Col-0相比,在两个转基因品系中检测到显着较高的SA水平,并且在四种基因型中35S :: TaBI-1.1#1含有最高的SA水平。 Col-0和atbi1-2之间的差异也达到了显着水平(图2D)。在0和3dpi时测量 atbi1-2,Col-0和两个转基因品系的叶片中的细菌滴度。在初始接种量(0dpi)中,在四种基因型中没有观察到致病细菌生长的显着差异。在3dpi时,两种转基因品系的细菌滴度明显低于Col-0,Col-0的细菌滴度也明显低于atbi1-2,表明两种转基因品系对致病细菌的生长有较强的抑制作用,并且atbi1-2比Col-0更容易感染病原菌(图2E)。基于两个转基因株系中较高水平的35S :: TaBI-1.1#1,使用35S :: TaBI-1.1#1来进一步检测PR1的表达。高SA水平诱导PR基因的表达以增强植物对病原体攻击的抗性。 PR1表达的增加或许可以解释对Pst感染抵抗力的增强(图2F)。

图2. TaBI-1.1转基因拟南芥对Pst DC3000的抗性增强

3.TaBI-1.1正向调节的SA相关基因表达
PR基因表达与SA积累和系统获得性抗性(SAR)有关。进一步检测了常规条件下生长2周龄Col-0,atbi1-2和35S :: TaBI-1.1#1幼苗中SA相关基因的表达。与Col-0和atbi1-2相比,在35S :: TaBI-1.1中观察到PR1,PR5,ICS1和EDS1有显着高表达水平。 然而,在这些基因表达水平中Col-0和atbi1-2之间没有检测到显着差异(图3)。 与Col-0相比,35S :: TaBI-1.1中PR1和PR5的表达水平分别增加了约11倍和9倍。 PR2,ICS1和EDS1表达的倍数变化低于PR1和PR5表达的变化(图3)。因此,TaBI-1.1上调PR1,PR2,PR5,ICS1和EDS1基因的表达,表明 TaBI-1.1在SA信号传导中起正向调节作用。

图3. 通过qRT-PCR检测正常条件下生长的atbi1-2,Col-0和35S :: TaB1-1.1 2周龄幼苗中5个SA相关基因的表达水平。

4.TaBI-1.1降低了SA和ABA的敏感性
将Col-0,atbi1-2和35S :: TaBI-1.1的4日龄幼苗置于含有不同浓度SA,NaCl和ABA的MS培养基中,以研究Col- 0,atbi1-2和35S :: TaBI-1.1转基因拟南芥植株在苗期响应SA和其他胁迫处理的不同表型。 13天后监测到形态学变化。在没有生长调节剂的MS培养基上(MS0),在任何两种基因型的Col-0,atbi1-2和两种35S :: TaBI-1.1转基因品系之间没有观察到显著差异的根长,侧根或鲜重(图4A,E-G)。在补充有30μMSA的MS培养基上,atbi1-2与Col-0在鲜重,根长和侧根数量上显示出较大的差异(图4H-J)。 35S :: TaBI-1.1#2的侧根数也与Col-0的侧根数显着不同(图4J)。在含有30μMSA的MS培养基上生长的植物中,Col-0的异常生长程度介于atbi1-2和35S :: TaBI-1.1之间(图4H-J)。高浓度SA会增加H2O2的积累并导致氧化损伤。当置于含有50μMSA的MS培养基上时,幼苗显示更明显的生长畸形。这些结果显示,在SA浓度较高的情况下,幼苗遭受更严重的SA胁迫。用高浓度SA处理的叶子比用MS0培养基处理的叶子绿色浅,黄色淡和叶子小(图4B)。在含有50μMSA的MS培养基上生长的35S :: TaB1-1.1#1的根长显着长于Col-0(图4K)。35S :: TaBI-1.1#1的鲜重和侧根数与Col-0相比显着增加(图4L,M)。因此,SA不仅影响叶子的大小和颜色,而且影响根长,鲜重和侧根数。
此外,研究人员检查了在含有NaCl和ABA的MS培养基上生长的幼苗的表型。 在含有100和120mM NaCl的MS培养基上生长的植物之间没有观察到显着差异(图4C,N-S)。在用20μMABA处理后,atbi1-2的畸形程度比 Col-0和35S :: TaBI-1.1更明显(图4D)。 根据统计学分析,atbi1-2与Col-0相比在根长,鲜重和侧根数上显示出显着差异,表明atbi1-2对ABA更敏感(图4T-V)。 然而, 30μMABA处理中未观察到根长,鲜重或侧根数的明显差异(图4W-Y)。 因此,TaBI-1.1转基因拟南芥对高浓度SA表现出降低的敏感性,并且atbi1-2突变体对ABA表现出增加的敏感性。

图4. 在含有SA,NaCl或ABA的MS培养基上生长的atbi1-2,Col-0和35S :: TaB-1.1幼苗根长,鲜重和侧根数的统计分析。

研究者进一步研究了TaBI-1.1在发芽过程中对ABA的敏感性。 在不同浓度的ABA的培养基上每12小时记录发芽种子的百分比。在MS0培养基中,Col-0,atbi1-2和35S :: TaBI-1.1转基因拟南芥植物显示相似的发芽率(图5A)。 含有0.5μMABA的培养基中,两种转基因株系萌发显着快于Col-0和atbi1-2(图5B)。 在含有1μMABA的培养基上观察不到显着差异(图5C)。 在含有2μMABA的培养基上,Col-0和两种转基因品系也比atbi1-2稍快地萌发(图5D)。 以上结果表明,TaBI-1.1转基因拟南芥对ABA的敏感性较低。

图5. TaBI-1.1转基因拟南芥在萌发过程中对ABA的敏感性降低。

5.拟南芥RNA-Seq分析中TaBI-1.1的表达
研究人员对35S :: TaBI-1.1#1和Col-0植物进行了RNA-seq分析,以更好地理解TaBI-1.1功能。鉴定出48个上调基因和58个下调基因并做了一个热图。使用GO分析将差异表达的基因功能分类。富集了30多个GO terms,如图6所示。对于上调的基因,富集的GO terms主要集中在抗生物胁迫,细胞免疫应答和SA合成与代谢相关的生物过程上。前10个关键的Go terms分别是防御反应、对外部刺激的反应、对生物刺激的反应、对外部生物刺激的反应、多生物体过程、对另一个生物体的反应、对另一个生物体的防御反应、对压力的反应、单一生物体代谢过程和对化学物质的反应(图6A)。对于下调的基因,富集的GO terms集中在细胞组分上,并且前三项是细胞组分,膜和细胞周围(图6B)。选择七个上调基因和三个下调基因进行qRT-PCR实验,结果表明,qRT-PCR结果与RNA-seq分析一致。

图6. 使用RNA-seq分析GO terms在35S :: TaBI-1.1和Col-0之间差异表达的基因的富集

KEGG富集分析差异表达基因被呈现为散点图。 使用富集因子、q值和通路中富集的基因数量来测量富集程度。 富集因子越高表示富集程度越高。观察到上调基因富集了20多个KEGG通路。上调基因的前20个富集通路中,其中光合作用是最明显的富集途径(图7A)。 光合作用的富集因子达到0.09,而q值大约为0。相反,下调基因的KEGG富集通路并不明显,只有6个富集因子较低的通路被鉴定出来(图7B)。因此,TaBI-1.1参与对生物胁迫的应答并主要通过基因上调表达来执行其防御功能。

图7. 35S :: TaBI-1.1和Col-0差异表达基因的KEGG富集分析

6.TaBI-1.1与TaPIP1相互作用并在ER膜上与TaPIP1共定位
将TaBI-1.1置于PGBKT7(BD)载体中,用作诱导蛋白在酵母双杂交实验中筛选小麦cDNA文库,以进一步探索TaBI-1.1调节应激反应的细胞机制。 结果,鉴定出一个候选的相互作用物质,水通道蛋白TaPIP1。 使用酵母双杂交和pull-down测定来确定TaBI-1.1和TaPIP1之间在体内和体外的相互作用。将融合TaBI-1.1(BD-TaBI-1.1)的BD载体和融合TaPIP1(AD-TaPIP1)的pGADT7(AD)载体转化到酵母细胞中。只有用BD-TaBI-1.1和AD-TaPIP1转化的酵母细胞能够在缺乏Trp,Leu,His和Ade(SD / -Trp-Leu-Ade-His)的选择性培养基上生长。转换TaBI-1.1和TaPIP1的融合载体产生相同的结果,表明TaBI-1.1与TaPIP1在酵母细胞中有相互作用(图8A)。使用pull-down分析进一步确认相互作用(图8B)。将TaBI-1.1克隆到pCold TM TF表达载体中在大肠杆菌中产生重组蛋白TF-His-TaBI-1.1。通过将序列克隆到pGEX-4T-1载体中,在大肠杆菌中成功产生了重组GST(谷胱甘肽S-转移酶)-TaPIP1蛋白。使用抗His抗体的Western印迹所示,体外pull-down测定显示TF-His-TaBI-1.1与GST-TaPIP1有物理互作(physically interacted)(图8B)
AtBI-1定位于ER膜上,研究者在小麦原生质体中检测了TaBI-1.1-GFP和mRFP-HDEL的共定位以确定TaBI-1.1的亚细胞定位。GFP和mRFP荧光的重叠系数 是0.69,表明TaBI-1.1与ER膜上的HDEL共定位(图8C)。 鉴于TaBI-1.1和TaPIP1之间的相互作用,研究者还检测到TaPIP1-GFP和mRFP-HDEL之间的共定位以及TaBI-1.1-GFP和TaPIP1-mRFP在小麦原生质体中的共定位(图8C)。 结果显示TaBI-1.1和TaPIP1共定位于ER膜。
通过qRT-PCR检测响应多次处理的TaPIP1的表达水平。 SA,NaCl和ABA处理使TaPIP1表达上调,这意味着TaPIP1可能参与对生物和非生物胁迫的反应(图8D)。

图8. TaBI-1.1和TaPIP1的相互作用和亚细胞定位

7.TaPIP1增加了拟南芥对PstDC3000感染的抗性
为了进一步研究TaBI-1.1和TaPIP1之间相互作用的潜在功能,研究人员构建了一个在 CaMV 35S启动子控制下表达TaPIP1的转基因拟南芥。选择了两个独立的转基因品系: 35S :: TaPIP1-1和35S :: TaPIP1-2,且TaPIP1的表达水平较高,这通过qRT-PCR分析进行了验证(图9A)。鉴于SA处理下TaPIP1水平的上调,推测TaPIP1也可能参与对病原体感染的响应。为了验证这个想法,研究者在Pst DC3000感染下检测了TaPIP1转基因拟南芥的叶表型。在模拟处理下,Col-0和两个转基因品系的叶片中没有观察到差异(图9B)。在用Pst DC3000接种后,发现Col-0叶片上明显的褪绿症状,相反,两种转基因植物的褪绿症状较轻(图9C)。为了进一步证实TaPIP1转基因拟南芥中的抗性增加,在0和3dpi测量叶片中的细菌滴度。如图9D所示,在初始接种量中Col-0和两个转基因品系之间没有显着差异,但是在3dpi时两个TaPIP1转基因拟南芥中的Col-0的细菌滴度显着低于Col-0,表明TaPIP1转基因拟南芥中病原菌的生长受到很大抑制。因此,TaBI-1.1和TaPIP1在响应Pst DC3000感染时表现出类似的作用,并且研究者推测TaBI-1.1和TaPIP1之间的相互作用可能涉及防御反应。

图9. TaPIP1转基因拟南芥对Pst DC3000表现出增强的抗性

创新点:

BI-1是一种局限于内质网(ER)膜的细胞保护蛋白,在对生物和非生物胁迫的应答中发挥重要作用。迄今为止,虽然已经鉴定了几种与BI-1相互作用的蛋白质。然而,关于BI-1在内质网应激中机制的认知非常有限,BI-1调节植物内质网应激反应的机制目前尚不清楚,该研究中,通过禾谷镰刀菌(Fg)处理的小麦的RNA-seq数据分析确定了小麦BI-1基因TaBI-1.1,揭示了TaBI-1.1和TaPIP1在响应病原体感染的ER膜上的相互作用的可能作用。

参考文献:
Lu P P, Yu T F, Zheng W J, et al. The Wheat Bax Inhibitor-1 Protein Interacts with an Aquaporin TaPIP1 and Enhances Disease Resistance in Arabidopsis[J]. Front Plant Sci, 2018, 9:20.

 

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