随着高通量测序技术的出现,测序数据量呈现指数级增长,各类公共数据规模日益庞大,公共数据整合分析已逐渐成为很多研究中的一项重要分析手段。利用公共数据一方面可以降低研究成本,另一方面可以补充一些受限于研究者研究背景与技术水平而难以自主检测的关键数据。截至目前,高通量测序数据库SRA数据库已收录超过10Pbase的NGS数据,但是由于公共数据整合分析过程中下载、存储和分析各个环节都存在较高的技术门槛,导致研究者对公共数据的利用不充分。对于这些问题百迈客已经提供了非常成熟的解决方案,一键式导入即可完成数据的下载和存储,辅以平台上多达25个高度集成化的分析流程,可视化界面助您轻松搞定分析难题。中国农业科学院马有志老师课题组的徐兆师研究员等研究人员在百迈客云平台结合公共数据完成拟南芥抗病性研究,成果于2018年1月22日发表在《Frontiers in Plant Science》上,影响因子4.298。 摘要 Bax抑制剂-1(BI-1)是真核生物中进化保守的内质网(ER),定位细胞死亡抑制因子。 BI-1抑制生物和非生物胁迫的能力在拟南芥中得到了充分研究,而小麦中BI-1的功能在很大程度上是未知的。在这项研究中,将禾谷镰刀菌(Fg)处理的小麦进行RNA-seq分析,然后分离小麦BI-1基因TaBI-1.1。通过水杨酸(SA)处理诱导TaBI-1.1表达,并通过脱落酸(ABA)处理诱导TaBI-1.1的下调。基于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色,TaBI-1.1在成熟叶和根中表达,但不在下胚轴或幼叶中表达。 TaBI-1.1在拟南芥中的组成型表达增强了其对丁香假单胞菌病毒(Pst)DC3000感染的抗性并诱导SA相关基因表达。此外,TaBI-1.1转基因拟南芥显示出由高浓度SA引起的损害的减轻,并降低了对ABA的敏感性。与表型一致,35S :: TaBI-1.1和Col-0植物的RNA-seq分析显示TaBI-1.1参与生物胁迫。这些结果表明,TaBI-1.1正向调节SA信号并在对生物胁迫的响应中起重要作用。此外,TaBI-1.1与水通道蛋白TaPIP1相互作用,并且它们都定位于ER膜(内质网膜)。此外,研究人员证明了SA处理后TaPIP1上调,并且TaPIP1转基因拟南芥增强了对Pst DC3000感染的抗性。由此表明,在ER膜上TaBI-1.1和TaPIP1之间的相互作用可能发生在对SA信号和防御反应的响应中。 材料和方法 使用拟南芥Columbia-0(Col-0)作为TaBI-1.1过表达的背景, 突变体atbi1-2从拟南芥生物资源中心(ABRC)获得。 从栽培的小麦品种小白麦扩增TaBI-1.1和TaPIP1的cDNA, 将PCR产物克隆到pLB载体中,使用DNAMAN 6.0软件进行氨基酸序列同一性比较。 RNA-Seq Analysis 收集来自4周龄Col-0和转基因系35S :: TaBI-1.1的叶片用于RNA-seq分析,使用HiSeq 2500平台测序。测序数据与TAIR 10拟南芥参考基因组比对。使用TopHat和Cufflink软件包进行mRNAseq数据分析以及DEG的鉴定和分析。通过GOseq软件进行差异表达基因的GO富集分析。根据KEGG数据库通路进行KEGG富集分析,寻找差异表达基因的富集通路。在百迈客云平台(BMKCloud)完成小麦Fg处理的RNA-seq数据下载和分析, SRA数据库(登录号:PRJNA289545)。 其他实验:1.qRT-PCR分析;2.转基因拟南芥植株在胁迫处理下的应答及性状评价;3.β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性测定;4.细菌接种和细菌生长的监测;5.酵母双杂交系统;6.Pull-Down assay(免疫沉淀法);7.亚细胞定位测定;8.ELISA Assay(酶联免疫吸附试验) 分析结果 1.通过qRT-PCR和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色确定TaBI-1.1的表达模式 研究人员分析了来自Fg处理的小麦RNA-seq数据,以研究植物防御信号通路。从RNA-seq分析中分离出前10个差异表达基因。在这10个基因中鉴定了两个小麦BI-1基因:TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980。 TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980在之前的研究中被命名为TaBI-1。在小麦Ensembl数据库中仅筛选出三种BI-1基因:TaBI-1,TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_488014_AA1573990。在两个差异表达的BI-1基因中, TaBI-1.1的差异最大。根据氨基酸比对,TaBI-1.1与TaBI-1同一性达到99.19%。与对照相比,Fg处理对TaBI-1.1的表达水平上调24倍。许多关于AtBI-1的研究已经证实AtBI-1在植物中对生物和非生物胁迫的抗性中起关键作用。 TaBI-1.1蛋白的序列与AtBI-1有69.88%的同一性,表明该序列在BI-1家族中基本保守。使用qRT-PCR监测TaBI-1.1的表达模式以确定TaBI-1.1在生物和非生物胁迫中可能的作用。TaBI-1.1的表达在响应SA处理时显着上调,在响应ABA处理时下调。 SA处理48小时后TaBI-1.1表达达到8倍高峰(图1A)。 响应ABA处理的下调水平在8小时达到初始水平的约1/5(图1C)。 响应NaCl处理,表达水平在4小时后下降,在2小时稍微增加并且在8小时后回到其初始水平(图1B)。 研究者创建了含有1.7kb TaBI-1.1启动子并生成转基因拟南芥的PBI :: GUS融合构建体,以研究TaBI-1.1的空间表达模式。使用GUS染色测定组织GUS活性。在成熟叶和根中有TaBI-1.1表达,但在下胚轴和幼叶中观察不到(图1D)。还检测了各种小麦组织中的TaBI-1.1表达水平,包括根,茎,叶和小穗,结果表明TaBI-1.1的表达在这些小麦组织中普遍存在,而且在叶中最高,在小穗中最低(图1I)。在SA和NaCl处理之后,成熟叶中的表达与对照相比增加,并且SA处理的表达更高。当SA和NaCl处理时,在下胚轴中也检测到表达(图1E,F)。在ABA处理的植物的叶子中检测到较弱的表达(图1G)。通过qRT-PCR进一步证实GUS表达水平(图1H)。以上结果表明,TaBI-1.1在各种胁迫下均有表达。 图1. 通过qRT-PCR和GUS染色评估TaBI-1.1的相应表达模式 2.TaBI-1.1的表达增强了拟南芥对Pst DC3000感染的抗性 经过Fg和SA处理后表达上调,假设TaBI-1.1可能参与生物胁迫反应。研究人员在拟南芥中异位表达TaBI-1.1,在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的控制下验证这一假设。选择两个TaBI-1.1表达水平相对较高的纯合株系3和7(35S :: TaBI-1.1#1和35S :: TaBI-1.1#2)用于进一步分析(图2A)。将atbi1-2,Col-0和两个转基因品系的四周龄叶子进行Pst DC3000感染或10mM...

近年来,学术圈掀起一阵浪潮——搭乘高通量测序的快车,多组学辅助研究科学问题。随着测序分析技术和服务流程日趋成熟,如何更高效更便捷地获取数据,成为群雄逐鹿的赛场。 在这个风起“云”涌的时代,百迈客云一夫当先,于2014年5月开始开放试用。百迈客云集结可视化数据分析APP、个性化分析小工具、文献检索、公共数据库、培训视频,是科研工作者项目管理一站式平台。历经4年的打磨,百迈客云以快速、全面、透明的姿态再次起航。  快速 近期,云分析12个转录组样本最快可在12小时左右交付结果。 根据百迈客研发团队最新公布的项目实测数据可以看出,12个水稻有参转录组共81.1G数据量,在专业版账号中最快可以12小时58分交付结果。无参转录组分析数据表明,在生产账号中,山雀(36G)和蚱蜢(62G)最快可在1天16小时完成分析。 百迈客转录调控三大产品云分析极速周期:   产品 云分析极速周期 有参转录组 12h/12个样品 miRNA 12h/12个样品 无参转录组 4d/12个样品 全面 1、标准分析APP+个性化分析+72款免费小工具 标准分析功能可一键式操作获得结题报告,个性化分析功能可自定义参数方案,并支持界面式数据挖掘。小工具可覆盖各种组学分析,图形化操作界面和高效的运算能力让使用更简便、分析更快速、参数更透明。 目前百迈客云已经上线多款APP,转录调控的真核有(无)参转录组、小RNA 、lncRNA已在云上稳定运行,结果可实现交互,后续还将扩展到更多的产品! 标准分析 个性化分析 免费小工具 数据质控 基因检索 热图 文库质量评估 韦恩图 韦恩图 参考基因组比对/转录本组装 聚类热图 注释分类图 表达量分析 蛋白互作网络 箱线图 基因结构分析(SNP、INDEL、AS、CDS、SSR、新基因) WGCNA 散点图 相关性分析 转录因子预测 FASTA文件提取、合并、切分、统计 差异基因筛选 目标基因集筛选及绘图 ...

Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice   发表杂志:Experimental & Molecular Medicine 影响因子:5.063 PMID:28857085   前言 高血压的患病率不断增加,正在成为世界范围内的主要公共卫生问题,但是高血压的发病机制还不完全清楚。 肾损伤和功能障碍可能是导致血压升高的主要原因之一,一些证据表明 盐摄取能够上调细胞因子的表达并增加肾脏损伤,但高盐(HS)摄入与肾损伤发展之间的关系尚不清楚。本文研究人员用HS水喂养小鼠持续8周,并研究由此产生的肠道病理生理变化及其对早期肾脏异常的影响。   材料和方法 使用6至8周龄的雄性特异性无病原体C57BL / 6小鼠。根据处理方法分为:对照组(饮用水),HS实验组(饮用水+ NaCl,8周),抗生素实验组(饮用水+ NaCl+多粘菌素B+新霉素,8周)。 分析内容如下:1.微生物分析;2.组织分析;3.基因表达分析,RNA-Seq使用百迈客BioMarker Technologies(Beijing,China)Illumina HiSeq 2500平台;4.蛋白质表达和生化分析;5.FD-4渗透性实验;6.粪便微生物群移植(FMT);7.统计分析   分析结果 1.慢性高盐摄入导致肠道生态失调 首先,研究人员检查HS摄入是否会影响肠道细菌。慢性HS喂养后,盲肠中的总细菌负荷略有下降,但无显著变化(图1a)。慢性HS喂养后,回肠上皮(图1b)和结肠腔内(图1b)的细菌负荷也降低。慢性HS处理显着降低厚壁菌门和提高拟杆菌的水平,这表明细菌组合物在HS摄入后发生改变。 图1. 慢性高盐喂养减少肠内的细菌负荷 为了研究HS摄入如何影响肠道微环境,研究人员将HS组的细菌组成与对照组相比,在HS处理后,盲肠中Actinobacteria,Firmicutes和Bacteroidetes在门水平和Actinobacteria以及Clostridia和Bacteroidia的百分比显著不同。unweighted uniFrac分析结果显示HS和对照组分别聚集(图2b)。进一步分析显示,HS和对照组在回肠粘液层分别聚集(图2c),而对照组和HS组形成两个聚类,分离趋势明显在结肠粘液层(图2d)。研究结果表明,慢性HS喂养可能导致肠道生态失调,细菌计数和微环境组成的变化也证明了这一点。 图2. 慢性高盐喂养引起肠道生态失调 2.慢性高盐喂养导致消化道反应受损的肠道异常 肠道生态失调通常与肠道病理生理学的改变有关,研究人员检查了慢性HS喂养对肠道变化的影响。在对照组和HS-喂养组小鼠的回肠和结肠上皮细胞形态没有差异(图3a)。此外,通过TUNEL和ki67染色鉴定的相似数量凋亡和增殖细胞表明,慢性HS喂养不影响肠道中的细胞死亡(图3a)。然而,研究人员发现炎症标志物表达被慢性HS摄入显著改变。特别是,Ccl4,Ccl5和Ifn-γ在HS小鼠的回肠中表现出更高的mRNA水平(图3b)。 IFN-γ免疫组织化学在回肠中的结果证实了基因表达数据(图3c)。由于TLR家族蛋白和Nf-κB是参与病原体相关免疫应答的主要分子,进一步评估TLR家族和Nf-κB基因表达,发现TLR2,TLR3和TLR5mRNA水平在回肠中趋于更高(图3d)。同时,HS处理后IRF7,GATA3和NFKB2的表达显著上调(图3e)。此外,HS喂养后白细胞中CD38的表达在回肠中升高(图3f)。然后通过RNA测序进行转录组分析,并比较涉及“细胞因子 - 细胞因子受体相互作用”,“ NF-κB信号通路“和”Toll样受体信号通路“。在回肠和结肠中,两组之间许多基因的表达是不同的。总的来说,这些数据表明慢性HS摄入导致肠炎症反应中断。 图3. 慢性高盐喂养与肠道炎症反应中断有关 3.慢性高盐摄入导致肠屏障功能丧失并促进细菌易位进入肾脏 肠道免疫反应受损始终与肠道屏障功能障碍有关,研究人员研究了HS的摄入如何影响肠道屏障功能。HS摄入显着降低了tjp-1,tjp-2,claudin-1,claudin-7和claudin-8基因的表达(图4a)。 此外,与对照小鼠相比,HS摄入后,回肠和结肠中屏障形成的紧密连接ZO-1蛋白水平和结肠中的Occludin蛋白水平显示出较低的趋势(图4c和d)。 另一方面,在HS喂养回肠和结肠后,成孔紧密连接蛋白Claudin-2蛋白水平显着较高(图4c和d)。这些数据清楚地表明肠道肠道屏障被慢性HS摄入所破坏。 肠道通透性增加可能导致肠道细菌或细菌产物易位至肠外组织。通过使用16s PCR来识别细菌DNA,检测到肾脏,肝脏和脾脏中的细菌移位。有趣的是,慢性HS摄入特异性促进了细菌移位进入肾脏,但不能进入肝脏或脾脏(图4e)。进一步分析了肾细菌,发现与基于LEfSe测量的对照相比,属于肠道细菌的杆菌被发现在HS处理的肾中富集(图4f)。特别是,与对照动物的肾脏相比,在HS喂养的肾脏中,芽孢杆菌和Planomicrobium的水平分别增加2.6倍和8.7倍。这些结果表明慢性HS摄入可以促进某些细菌的易位。该数据清楚地表明HS喂养与肠道屏障破坏和肠道细菌易位进入肾脏有关。 图4. 慢性高盐喂养导致肠道屏障功能障碍并促进细菌移位进入肾脏 4.慢性高盐喂养相关的肠屏障破坏和肾损伤取决于肠道微生物群 为了进一步阐明HS摄入后肠道生态失调和肾损伤之间的关系,给小鼠喂养多粘菌素B和新霉素。抗生素给药确实恢复了HS饲喂诱导的回肠Ifn-γ过表达,通过粪便白蛋白和FD-4渗透监测肠道泄漏,以及通过血浆内毒素水平和肾脏16s / 18s比率监测的细菌移位,通过尿和血浆Na +浓度测量,抗生素不改变钠负荷(图5a)。虽然8周HS喂养并未引起纤维化等进展性肾损伤,但由col1a1 mRNA水平监测(图5b),HS喂养增加了血浆肌酐水平。更重要的是,与对照组小鼠相比,HS-喂养小鼠肾功能障碍的主要标志物尿白蛋白/肌酐比率显着增加,抗生素治疗几乎可以完全恢复肾功能(图5d)。另外,TUNEL染色显示抗生素施用可以降低HS诱导的凋亡细胞的升高(图5e和f)。总之,该数据表明,抗生素治疗能够改善肠道渗漏和HS喂养引起的早期肾损伤。 图5. 抗生素改善慢性高盐喂养引起的早期肾损伤 5.慢性高盐喂养引起的收缩压升高取决于肠道微生物群 慢性HS喂养可能导致动脉压升高,并且研究人员还检测到抗生素如何影响这种进展。 如图6所示,虽然HS处理的小鼠的DBP和平均血压没有增加,但是慢性HS喂养后SBP明显升高。...

百迈客云是面向生物大数据分析的开放云平台,为用户提供包括生物信息分析APP、计算资源、公共数据、信息分析培训的整合服务,是科研工作者项目管理一站式平台,相比传统线下科技服务,能随时随地在线检视项目全程进展,国内首家实现云端结果全交付。更值得骄傲的是,近期云分析12个样本最快可在6小时交付结果,有图有真相。 根据百迈客研发团队最新公布的项目实测数据可以看出,12个水稻有参转录组共81.1G数据量,在专业版账号中最快可以12小时58分交付结果, 根据样本特异性和数据量的差异性结果交付时间会有不同。 表1. 有参转录组各账号运行参数 (注:以上生产账号均指百迈客内部信息生产人员所用账号,处理的均为实际项目) 无参转录组分析数据表明,12个玉米样本共76.9G,专业版账号中最快可以在2天5小时完成交付。而在生产账号中,山雀(36G)和蚱蜢(62G)最快可在1天16小时完成分析。 表2. 无参转录组各账号运行参数 sRNA分析数据表明,水稻12个样本,共9.59G,在专业版账号中最快可以6小时29分完成分析。另外,在客户专业版账号中,6个黄瓜样本,共3.8G数据,最快4小时完成分析任务。 表3. sRNA各账号运行参数 由上可见,百迈客云分析已到一个很快的交付速度,无论是对次账号/年账号的客户,还是对走传统线下项目分析的客户。对所有转录调控项目的(现阶段是有参、无参、miRNA)客户,百迈客已实现生产上云,即线下项目也通过云来投递任务!后续还将扩展到更多的产品! 百迈客云次账号:客户以次(G)为单位付费,在一定计算资源和固定APP内自主完成1 次主流程分析及使用该项目APP长达 1 年的个性化分析。 百迈客云年账号:分标准版(8核32G内存)、专业版(8核32G内存*4+16核96G内存)和豪华版(8核32G内存*8+16核256G内存)三种,专业版账号可使用4款APP和100多款小工具,APP可覆盖转录调控、个体重测序、微生物多样性等。 (注:以上APP均指包含标准分析和个性化分析的集成化分析流程,图形化界面操作。次账号所用计算资源最低为年账号的专业版计算资源) 百迈客转录调控三大产品有参转录组、无参转录组和miRNA已实现以下云分析极速周期: 无论您选择百迈客的常规建库测序分析服务,还是选择百迈客云的次账号/年账号,均为云上分析,均可实现以上分析速度,让您体验云服务的高效快捷!项目进度快人一步,加速完成项目! 百迈客也是首家实现手机微信端查询项目进展功能的基因测序公司! 1. 实时获取项目进展,项目信息获得更加直接; 2. 知悉阶段预计时间,项目周期把控更加清晰; 3. 自动通知关键节点,项目协调管理更加精准; 4. 评价延长账号期限,最多可延长期限 3 个月。 选择百迈客云服务,让您省心无忧,“掌”握进展,实现科研论文的快速高效转化!...

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英文名:Rice  Information  GateWay  (RIGW):  a  comprehensive bioinformatics platform for indica rice genomes 中文名:水稻信息网(RIGW):一个全面的籼稻基因组生物信息学平台 发表杂志:MOLECULAR PLANT 影响因子:8.827   Oryza sativa subsp.籼稻和O. sativa subsp. 粳稻是亚洲栽培稻的两个亚种,其中籼稻的种植面积更广,遗传多样性也更高。在过去的几年,水稻注释项目数据库(RAP-DB)(Ohyanagi等,2006)和密歇根州立大学水稻基因组注释项目(MSU-RGAP)(Ouyang等,2007)是两个受欢迎的数据库, 基于粳稻品种Nipponbare(国际水稻基因组测序项目,2005)的统一参考基因组的基因组和转录组数据。北京基因组研究所的水稻信息系统(BGI-RIS)(Zhao等,2004)是籼稻栽培品种93-11的可用资源,但由于缺乏高质量的籼稻参考基因组,其应用受到限制。 为了弥补这一缺点,研究人员构建了一个综合全面的平台:Rice Information GateWay(RIGW,http://rice.hzau.edu.cn/),提供基因组学,转录组学,蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPIs),代谢网络,代谢物和计算工具,以最新的籼稻珍山97(ZS97)和明恢63(MH63)(Zhang et al.,2016)为参考基因组。RIGW通过直观的Web的界面,为水稻研究提供丰富的基因组学和其他组学数据。 RIGW在Linux操作系统和Apache Tomcat Web服务器(http://tomcat.apache.org/)中实现。 所有的基因组数据,注释,同系物,基因表达,PPIs,代谢物和文献存储在MySQL数据库(http://www.mysql.com/)中。 图1A显示了RIGW中的体系结构,一些有代表性的资源和计算工具。 图A RIGW体系结构 RIGW上部署GBrowse(https://github.com/GMOD/GBrowse)用于ZS97和MH63基因组和转录组数据的可视化(图1B),分别选择了包括基因注释和标记叶子、圆锥花序以及芽中的RNA-sequencing。 图B GBrowse 另外,为ZS97,MH63和Nipponbare基因组之间的比较分析提供了Gbrowse_synteny工具(图1C),所有位于同一染色体区域的相应注释可以很容易的并行显示出来(每个基因组都可以设置为参考)。 图C Gbrowse_synteny工具 研究人员开发了一个灵活的查询界面来高效地检索和图形化显示各种数据。 例如,提供关键词的搜索引擎,用户输入关键词(例如基因位点,基因功能)就可以链接到详细页面(例如基因位置,基因结构,可变剪接,其他品种水稻中的同源物, 核苷酸和氨基酸序列,基因表达水平等)。 此外, Gene Ontology(Harris等,2004),InterPro域信息,预测亚细胞定位和蛋白质 - 蛋白质相互作用以及外部数据库链接在可以获得的情况下都列在搜索结果中(图1D)。 提供局部序列比对搜索工具(BLAST)作为碱基序列的搜索引擎,可以查找在籼稻ZS97,MH63,93-11和粳稻日本晴中的同源序列,比对结果通过图形和文本的格式呈现。 图D 搜索结果展示 在补充表1和RIGW主页中列出了ZS97和MH63基因组特征。研究人员根据相关文献,在不同品种水稻中手动收集了2000多个克隆的基因,和2500多个具有详细注释信息的水稻代谢物。利用CREP(http://crep.ncpgr.cn/)的数据,研究人员建立了一个友好的网络界面,用于查询和显示ZS97,MH63及其杂种汕优63(SY63)生命周期中39个组织的基因表达水平。对于给定的基因,可获得的所有组织表达量信息,这极大地促进了其表达模式的研究。由于全基因组PPI网络对研究整体细胞反应非常有用,研究人员从公共数据库收集了1,871,563个非冗余水稻PPIs(其中929个为实验确定的PPIs),包括PRIN(Gu et al.,2011), RiceNet(Lee等,2015)以及RIGW中的相关文献。用户可以在PPI搜索页面上提交一个或多个ZS97...

发表杂志:Plant Growth Regulation 影响因子:2.646 摘要 荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是一种重要的水果作物,起源于中国,并在世界热带和亚热带地区商业化种植。荔枝红色果皮的颜色是荔枝果实市场接受度的重要品质,果皮的粉红色/红色是花青素生物合成和积累的结果,花青素-3-葡萄糖苷和花青素-3-芸香糖苷是荔枝红果皮中的主要花青素。荔枝花青素的数量和组成在不同的品种间差异很大,也很大程度上受各种环境因素的影响。因此,深入了解荔枝中花青素生物合成的调控具有重要的科学意义和经济意义。 许多研究表明,花青素生物合成很大程度上受植物激素的影响。外源脱落酸(ABA)处理促进荔枝花青素生物合成,而外源性N-(2-氯吡啶-4-基)-N'-苯基脲(CPPU)抑制荔枝花青素生物合成。但是,ABA或CPPU调控花青素生物合成的机制仍不清楚。为了进一步了解外源ABA和CPPU调控荔枝果实花青素生物合成的分子基础,华南农业大学园艺学院赵杰堂老师课题组对ABA或CPPU处理的荔枝果皮进行转录组测序,并进行了全面的分析。 材料和方法 选取生长十五年的L. chinensis cv,妃子笑。 三种处理方式:ABA处理,CPPU处理和对照处理(自来水),每组处理约15个果实簇。处理后分别取0,10和20天果皮圆盘,共取7组样本分别是:Cont-0,Cont-10,Cont-20,ABA-10,ABA-20,CPPU-10,CPPU-20,分别提取总RNA,用于RNA测序。 测序平台:北京百迈客生物科技有限公司Illumina Hiseq平台 150PE 分析平台:百迈客云平台(BMKCloud) 分析内容:1.原始数据质控;2.参考基因组比对(未发表);3.差异表达基因分析(韦恩图绘制,KEGG富集分析);4.基因功能注释(使用Blast2Go 基于Nr,Nt,COG,KO,GO数据库的最高相似性进行基因注释);5.统计分析 花青素和叶绿素含量的测定以及内源ABA分析 研究人员根据Wrolstad(1982)等人的描述进行相应的修改对果皮中总花青素含量进行定量,根据Arnon(1949)描述的方法计算总叶绿素含量,根据Jia(2011)等人所述,进行了一些修改,使用气相色谱 - 质谱(GC-MS)测定ABA含量,每个过程重复三次。 结果 1.经外源ABA和CPPU处理后,荔枝果皮的表型、色素含量和内源ABA水平的变化 处理10天后,ABA处理和对照处理的果实开始着色(图1a),尽管花青素含量没有显着差异(图1b)。然而,CPPU处理的果实只有一点点红色(图1a),并且花青素含量远远低于ABA处理和对照的果实(图1b)。处理后20天,ABA处理的果实变成均匀的红色,并且CPPU处理的果实仍然是绿色的,带有一点红色(图1a)。同时,对照果实呈现不均匀的红色(图1a),这是cv妃子笑的典型特征。如图1b所示,ABA处理20天后明显促进荔枝果皮花青素积累,而CPPU处理显着抑制荔枝果皮花青素积累。与花青素含量变化相反,果实成熟过程中叶绿素含量降低。显然,ABA处理加速叶绿素降解和CPPU处理延缓了这一过程(图1c)。ABA处理的果实与对照之间的内源ABA水平没有显着差异,而CPPU处理的果相比而言具有较低的ABA水平(图1d)。 图1.各处理组果皮颜色、花青素、叶绿素及ABA含量变化 2.RNA测序以及参考基因组比对 共构建7个文库,测序过滤后每个样本数据均不低于6.6Gb,平均GC含量为45.36%(表1)。与荔枝参考基因组比对(未发表),比对率是74.7%(表1)。 表1. RNA-Seq结果展示 3.外源ABA和CPPU处理后荔枝果皮基因表达谱的综合分析 三种处理后0天,10天和20天的荔枝果皮中发现了许多差异表达转录本(图2)。荔枝果皮色素沉着过程中,在对照组鉴定了2263个差异表达基因(DEGs)(图2a)。除此之外, 经过ABA(图2b)和CPPU(图2c)处理后的三个阶段分别鉴定了1986和2862个DEGs。 图2.三组处理中差异表达基因韦恩图 为了鉴定ABA和CPPU调控的花青素生物合成的DEGs,分别选择ABA / CPPU处理后10天和20天的DEGs与对照组进行比较。 与对照相比,在ABA和CPPU处理的果皮中分别有579和827个DEGs。 表达模式分析表明,在ABA处理10天和20天后,上调的转录本数量均比下调的转录本数量多。而 CPPU处理后20天上调的转录本数量比ABA处理的低很多。 4.外源ABA处理后的荔枝果皮表达分析 外源ABA处理组,对显著差异表达的基因进行GO分析,发现了与细胞过程,代谢过程,细胞,细胞部分,催化活性和转运蛋白活性有关的GO terms的富集。也做了DEGs的KEGG通路富集分析。 579个DEGs中的351个被富集到101个通路中,前5个通路组分别为:植物 - 病原体相互作用通路(49DEGs),植物激素信号转导(32DEGs),类黄酮生物合成(27DEGs),内质网中的蛋白质加工(27DEGs) 碳代谢(20 DEGs),淀粉和蔗糖代谢(20 DEGs)。 外源ABA处理的DEGs中,大部分与花青素合成有关的DEGs上调,如PAL,C4H,CHS,CHI,DFR,LDOX和GTs。此外, FLS和LAR等黄酮醇和原花青素合成基因上调, C3'H,COMT,F5H,CCR,CAD等木质素合成基因也上调了。 ABA处理后另一类显着差异表达的unigene参与植物激素代谢和信号传导。两个编码ABA生物合成途径中的关键酶的NCEDs unigenes显著上调,而ABA信号转导的基因在外源ABA处理后没有明显的变化。外源ABA处理也影响了与生长素信号途径有关的基因表达。例如,属于Aux / IAAs家族的两个unigenes上调。另外,编码DELLA蛋白,负调控GA信号转导的unigenes经ABA处理后上调。 5.外源CPPU处理的荔枝果皮表达分析 将CPPU处理组与对照组之间的DEG进行GO分析。 与外源ABA处理相比,差异不显着。KEGG富集分析, 897个DEGs中的493DEGs个被富集到117个通路,前六个通路组是碳代谢(54DEGs),植物 - 病原体相互作用(49DEGs),光合作用(42DEGs),氨基酸生物合成(38DEGs),苯丙素生物合成 (33DEGs),植物激素信号转导(32DEGs)。 与ABA处理不同的是,外源CPPU处理后许多上调基因参与碳代谢,氨基酸生物合成和光合作用的基因,特别是在CPPU处理后10天较明显。例如,unigene Litchi__GLEAN_10019646在外源CPPU处理10天后显着上调6.1倍,它编码捕光复合体II叶绿素a / b结合蛋白1。另外一类在外源性CPPU处理中显著差异表达的unigenes涉及叶绿素生物合成代谢。 CPPU处理后,大部分参与类黄酮和花青素生物合成的DEGs均下调,如PAL,C4H,CHS和LDOX。此外,黄酮醇和原花青素合成基因,如FLS和LAR也下调。有29个DEGs比对到植物激素信号转导途径。其中,ABA信号中的两个ABA受体PYR / PYL均被CPPU下调。另外,与生长素,GA和乙烯信号有关的基因大部分也下调。 6.ABA和CPPU处理的荔枝果皮的表达分析 受外源ABA和CPPU共同响应的DEGs共199个,其中大部分unigenes在两种处理组中显示出类似的改变。 值得注意的是,有10个unigenes在转录水平上表现出相反的模式。 其中,编码GST4蛋白的unigene(Litchi_GLEAN_10051861)被报道与荔枝中花青素的液泡转移有关。 ABA处理和CPPU处理之间的显着差异之一是叶绿素代谢。 鉴定了与叶绿素生物合成和降解有关的24个候选基因,其响应外源ABA和CPPU的表达模式如图3所示。总体而言,ABA处理对叶绿素生物合成和降解的基因表达没有显著影响。 与对照相比,CPPU处理显着提高大多数叶绿素合成基因,并下调TF...

ranscriptome Analysis of Floral Buds Deciphered an Irregular Course of Meiosis in Polyploid Brassica rapa  云平台助力芜菁花芽转录组比较分析解析多倍体异常减数分裂过程 杂志: Frontiers in Plant Science  影响因子:4.298 PMID:28553302 云平台助力郑州大学的老师们发表了一篇关于四倍体与二倍体芜菁转录组比较分析的文章,这是第一个同时在细胞和转录组水平证明染色体多倍性对减数分裂过程有不利影响的研究,有助于全面了解二倍体和多倍体芜菁减数分裂时花芽转录组的一致性和差异性。   研究背景: 多倍体化对于动植物进化及物种形成具有重要意义。染色体倍性增加在大多数植物中十分常见,约30-80%的被子植物在进化过程中历经这一过程,种内基因组复制可产生同源多倍体,种间杂交可产生异源多倍体。理解多倍体对植物繁殖的影响对于多倍体育种项目具有重要意义。 本文在细胞和分子水平对同源四倍体、二倍体芜菁的生殖组织(未成熟的花芽)进行了转录组比较分析。先进行细胞学分析,发现结果显著异常后,进行RNA测序分析,进一步阐明这种细胞学差异的分子机制。   材料和方法: 材料:温室中培育芜菁同源四倍体和二倍体,采集1-1.5mm的花芽。 细胞学分析:花芽制片观察染色体行为。 转录组分析:二倍体花芽样本T1,T2,T3,同源四倍体样本T4,T5,T6进行测序,筛选DEGs,进行功能注释及相关验证。   测序平台:Illumina HiSeq 2000 分析平台:BMKCloud,具体分析如下: 测序原始数据去接头、低质量序列后与参考基因组比对(TopHat2),对比对上的序列进行转录本重构,评估表达水平(Cufflinks)。鉴定DEGs(logFC≥2,FDR<0.01)并与Nr、UniProtKB\Swissprot、KOG、COG、GO、KEGG等数据库进行比对注释。   研究结果: 1.同源四倍体芜菁异常的减数分裂过程 减数分裂过程中染色体行为分析结果显示:二倍体中,同源染色体中期配对为二倍体,后期分离(图1A-D)。四倍体中,在减数分裂中期I形成多倍体和单倍体,在后期I、II发生不均等分离(图1E-L)。 图1 四倍体芜菁异常染色体行为 统计结果表明与二倍体相比,芜菁多倍体化后整个减数分裂过程发生了不规则变化。 图2 四倍体芜菁减数分裂中异常染色体行为分析 2.测序结果 每个样本文库得到29.07 GB clean read,Q30≥88.55% 。同源四倍体、二倍体比对到参考基因组效率分别为74.34%,75.88%。样本组的表达模式分析共得到40927个基因,其中有1001个新基因。 3.DEGs分析 40927个基因中,4601个基因是差异表达的(图3A),2343个上调,2259个下调(图3B),两组间DEGs占比较少((11.24%)。随机挑选DEGs进行层次聚类,分析表达模式(图3C),发现四倍体中K1、K3、K6、K9类别下调,K2、K4、K5、K7,K8类别显著上调。 图3 DEGs表达分析 与COG、GO、KOG、Nr、KEGG、Swiss-Prot比对后,97%的DEGs至少能与一个数据库比对上(表1) 表1 差异表达Unigene注释 COG分类中,2615个DEGs可归到25个COG类别(图4),其中包含最多DEGs的类别为:复制重组与修复(222个,8.49%),转录(261个,9.98%),一般功能(515个,19.69%),与KEGG结果一致。 GO分类中大多数DEGs聚类到细胞过程(61.97%),繁殖过程(15.49%),结合过程(42.96%)(图5)。 KEGG功能注释结果表明,4,601个DEGs中有1,453个可归到50个生物途径。高度富集的通路为:氨基酸合成(48个,3.3%),植物激素信号转导(61个,4.2%)和蛋白质加工内质网途径(47个,3.2%)(图6)。 图4 COG分类 图5 新DEGs的GO分类 图6 KEGG富集通路 4.减数分裂相关DEGs分析 为阐述四倍体芜菁减数分裂过程改变相关的遗传信息,选择以下明显与减数分裂相关的COG类别进行细分:(1)复制,重组和修复;(2)染色质结构和动力学;(3)细胞周期控制,细胞分裂,染色体分区;(4)细胞骨架。在4,601个位点中,共鉴定出288个与减数分裂相关的基因(图7A)。 应用拟南芥数据库(TAIR)的BLASTN搜索,进一步鉴定芜菁中减数分裂直系同源基因,11个两组间差异表达的已知减数分裂基因。如图7所示,显著富集的L组(复制,重组和修复)包含121个上调、102个下调基因,这组聚类结果(图8B)显示已知减数分裂基因(包括RAD54,DMC1和RPA)在四倍体芜菁中表达显著下调。D组(细胞周期控制,细胞分裂和染色体分配)中,10个下调,13个上调,已知的减数分裂基因DIF1/SYN1和CyclinA1-2/TAM上调(图7C)。在B组(染色质结构和动态变化)(图7D),有7个基因上调,包括已知调节开花时间和植物发育的NF-YB8基因,14个基因下调,包括组蛋白相关基因(H2AV和H4)。Z组(细胞骨架)中,8个基因上调,7个基因下调(图7E),且没有已知减数分裂相关基因。已知减数分裂基因MMD1和HOP2在一般功能组(R)中富集(图4)。HOP2,XRI1,ZYP1a和ZYP1b未归到任何COG组。 KEGG比对后将288个中的108个DEGs分配到28个途径,包括减数分裂相关同源重组(2.8%),DNA修复和重组(6.5%),DNA复制(3.7%),染色体和相关蛋白(4.6%)。 图7 COG分类中减数分裂相关基因分布及表达分析 同源重组对于真核生物减数分裂中SPO11蛋白质引起的DSBs的精确修复十分重要,作为调节关键介质的DMC1,RAD54和RPA在这个途径中显著下调。Cyclin-A1-2 / TAM是DNA复制途径中唯一与细胞周期蛋白有关的基因,表达上调。这些结果表明染色体集在同源四倍体中增加了一倍,与减数分裂有关的大多数基因可能通过上调或至少正常表达以满足减数分裂期间基因组含量增加的需求。否则,减数分裂关键基因下调可能会干扰四倍体减数分裂中染色体行为。 qRT-PCR 对24个减数分裂相关基因进行验证,20多个基因表达与测序结果一致。对拟南芥中直系同源基因分析结果显示两个物种减数分裂相关基因的总体表达模式相近。   结果: 本研究细胞学分析发现,合成多倍体整体减数分裂过程是显著不规则的。为从分子水平阐明这一过程的遗传基础,本文进行了同源四倍体和二倍体芜菁花芽间的遗传调节差异的转录组比较分析。在40927个表达基因中,同源四倍体芜菁花芽中鉴定出4601个DEGs,其中288个与减数分裂相关。DMC1(已知减数分裂特异性基因,与DSBs同源染色体依赖性修复相关)在同源四倍体芜菁中表达显著下调,可能与减数分裂I期的异常有关。某些RNA解旋酶,细胞周期、体细胞DNA修复相关的DEG在基因组复制后表达上调,减数分裂DSB修复有关基因表达显著下调。芜菁和拟南芥中减数分裂相关基因的总体表达模式相近。   创新点: 这是第一个在细胞和转录组水平证明染色体多倍性对减数分裂过程有不利影响的研究,有助于全面了解二倍体和多倍体芜菁减数分裂时花芽转录组的一致性和差异性。   参考文献:Braynen J, Yang Y, Wei F, et al. Transcriptome Analysis of Floral Buds Deciphered an Irregular Course of Meiosis in Polyploid Brassica rapa[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8:768....

The comprehensive liver transcriptome of two cattle breeds with different intramuscular fat content 不同肌内脂肪含量的两种牛中肝脏转录组研究 发表杂志:Biochemical and Biophysical Research Communications 影响因子:2.466 PMID:28669724   摘要 肌内脂肪(IMF)含量是牛肉质量的重要决定因素。晋南牛和西门塔尔牛之间的IMF含量有显着差异。在这里,为了鉴定与IMF沉积有关的候选基因和网络,研究人员深入探索了这两种牛中肝脏的转录组结构。研究人员对5个晋南牛和3个西门塔尔牛的肝脏进行转录组测序,产生了约4139M reads。共检测到124个差异表达基因(DEGs),在晋南牛肉中,有53个上调,71个下调。 此外,共鉴定了1282个潜在的新基因。GO分析显示,这些DEGs(包括CYP21A2,PC,ACACB,APOA1和FADS2)在脂质生物合成过程、胆固醇酯化调节、胆固醇逆向转运和脂蛋白脂肪酶活性的调节中显着富集。参与丙酮酸代谢途径的基因也显著过表达。此外,本研究还确定了一个与脂质代谢有关的相互作用网络,这可能是导致牛在基因组中沉积的原因。由此推论,参与调节脂质代谢的DEGs可能在IMF沉积中起重要作用。综上所述,研究者提出了一组候选基因和相互作用网络,可以与IMF沉积相关联,并用作牛的育种中的生物标志物。   背景 牛肉是人类食物最重要的蛋白质来源之一。在不同品种的牛之间,生长速度,肌肉质量和肉质存在显着差异。津南黄牛是我国五大黄牛品种之一,以其肉质鲜嫩,纹路鲜明而闻名。相比之下,源自瑞士的西门塔尔牛是世界上大量喂养的品种,主要用于生产好的乳品或肉质的品种,它们的生长速度较快,瘦肉含量高,以至于肌内脂肪(IMF)含量以及嫩度低于晋南牛肉。 IMF含量和肌肉纤维特性是肉品质的主要决定因素,包括感官特性(嫩度,多汁性和风味)和营养价值。IMF含量与牛肉感官品质性状呈正相关。西门塔尔牛和晋南牛的IMF含量差异使其成为比较基因组学研究的重要材料,用来研究牛肌内脂肪酸沉积的分子机制。 肝脏与脂肪组织和骨骼肌是哺乳动物脂质代谢和其他代谢过程中最重要的器官之一。它是非酯化脂肪酸吸收、氧化和代谢转化的中心器官。此外,它具有从头脂肪生成,细胞质三酰甘油储存,从葡萄糖和其他非脂质前体合成脂肪酸的酶活性。随着高通量测序技术的发展,已有对猪和乳鸽肝脏进行转录组研究,以探索影响IMF成分的潜在候选基因。日本黑色longissimus dorsi和荷斯坦黑白花牛转录组报告显示,在日本黑牛中,具有较强IMF沉积能力特征的差异表达基因中,大多数表达上调。并且鉴定了一个与细胞形态和脂质代谢相关的基因网络。然而,并没有两种不同IMF水平的牛肝脏比较转录组学研究。 在该研究中,使用RNA-Seq方法来分析西门塔尔牛和津南牛的肝脏转录组数据。这项研究的主要目标是确定差异表达的基因和相互作用网络,这可能有助于牛的肌内脂肪酸组成研究。 另外,该研究鉴定的候选基因可能会对牛的分子育种有帮助。   材料和方法 为了消除性别差异,该研究全部选择雄性牛。3头西门塔尔和5头晋南牛,生长1.5年,屠杀后30分钟内取肝脏组织,在液氮中快速储存,提取总RNA。 测序平台:北京百迈客生物科技有限公司Illumina Hiseq 3000平台,PE150 分析平台:百迈客云科技有限公司(BMKCloud) 分析内容:1.低质量reads质控; 2.参考基因组比对(Bos taurus参考基因组,版本UMD 3.1.1); 3.基因表达量和差异表达分析; 4.差异表达基因的功能富集分析; 5.蛋白质互作分析;   结果 1.西门塔尔牛和晋南牛肝组织RNA测序结果 使用Illumina Hiseq 3000平台对西门塔尔(n = 3)和晋南(n = 5)牛的肝进行转录组测序。质控后共获得61.33 Gb数据,约为牛基因组的23倍。8个样本的Q30均大于93%。与参考基因组比对率均在80.27%-85.48%范围内(表1)。 表1.RNA测序数据和比对结果统计 2.新基因的鉴定和注释 利用Cufflinks软件来鉴定西门塔尔牛和晋南牛的新基因。该研究中共检测到1282个潜在的新基因。 其中,有1043个基因通过与数据库(NR,Swiss-Prot,GO,COG,KOG,Pfam和KEGG)比对进行了注释。 值得关注的是,在Swiss-Prot蛋白质数据库中可以注释到364个新基因,这意味着它们是潜在的蛋白质编码基因,在之前的牛参考基因组中没有注释。 此外, GO和KEGG数据库中分别注释548和371个新基因。 3.差异基因表达分析 使用DESeq R软件包鉴定西门塔尔牛与晋南牛的差异表达基因(DEGs)。将Fold Change≥2且FDR<0.05作为筛选标准,共鉴定了124个显着的DEGs,其中晋南牛中有53个(42.7%)上调,71个(57.3%)下调(图2)。西门塔尔牛和晋南牛中17个新基因有显著差异。一些转录本在丰度上有很大的差异,如ENSBTAG00000047322(|log2-fold change| = 7.16),血红蛋白亚基beta(HBB,|log2-fold change|= 3.76)和超氧化物歧化酶1(SOD1,|log2-fold change |= 8.38)它们被认为与肌内脂肪酸组成相关的候选基因。 图1.两种牛中124个差异表达基因热图 4.差异表达基因功能富集分析 为了深入了解西门塔尔牛和晋南牛肝中差异表达基因的生物学关系,研究人员将差异表达基因进行GO,KEGG富集分析。结果显示, GO生物学过程中显著富集了23个terms,主要包括催化活性(GO:0043086),脂质生物合成过程(GO:0008610),胆固醇酯化调节(GO:0010872), 逆转胆固醇转运(GO:0043691)和脂蛋白脂肪酶活性的调节(GO:0051004)的负调节(P < 0.05)。 共有4个KEGG通路被显著富集(P <0.05),主要包括造血细胞谱系(bta04640),细胞粘附分子(CAMs,bta04514),丙酮酸代谢(bta00620)和T细胞受体信号传导通路(bta04660)(图2)。 图2.两种牛的差异表达基因GO富集中前20个显著富集的terms和KEGG通路分析 5.蛋白质相互作用分析 为了解西门塔尔牛和晋南牛肝脏中DEGs的相互作用,研究人员利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件进行了蛋白质 - 蛋白质互作网络分析。共鉴定了9个网络, 有趣的是,第二个网络与脂质代谢,分子运输和小分子生物化学相关,该网络包括乙酰辅酶A羧化酶β(ACACB),载脂蛋白A1(APOA1),脂肪酸去饱和酶 2(FADS2)和其他脂代谢相关基因(图3)。 图3.两种牛中差异表达基因的蛋白-蛋白互作网络图 结论 综上所述,该研究系统地比较了晋南牛和西门塔尔牛的肝脏转录组差异。 总共有124个被识别出来。 与这两个品种的IMF沉积差异一致,这些DEGs在脂质生物合成和代谢相关的生物过程和途径中富集。 与脂质代谢有关的相互作用网络也被确定。 总的来说,该研究提供了与IMF沉积有关的潜在的候选基因和调控网络,这对于产生更好的肉质的牛饲养是有用的。   创新点 在前期的报告中有较强IMF沉积能力特征的牛转录组研究,但是并没有两种不同IMF水平的牛转录组学研究。该研究中,使用RNA-Seq方法来分析两种不同IMF水平的牛肝脏转录组数据。鉴定了差异表达的基因和相互作用网络,这一结果为牛的肌内脂肪酸组成研究奠定了基础。此外,该研究鉴定的候选基因可能会对牛的分子育种有帮助。   参考文献 Xi W, Zhang Y, Zhang X, et al. The comprehensive liver transcriptome of two cattle breeds with different intramuscular fat content[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017:1018-1025....

云平台深度解析-小麦与禾谷胞囊线虫在侵染初始阶段的转录组学变化 Transcriptional responses of wheat and the cereal cyst nematode Heterodera avenae during their early contact stage 小麦与禾谷胞囊线虫在侵染初始阶段的转录组响应 杂志: Scientific Reports  影响因子:4.259 PMID:29101332   研究背景: 植物寄生线虫(PPNs)已给许多植物带来了巨大损害。禾谷胞囊线虫Wollenweber隶属禾谷胞囊线虫(CCNS),出现在80%的中国小麦种植区,致使小麦感染并减产30%到100%。许多寄生线虫可繁殖幼虫,幼虫用感官定位宿主,这种复杂的行为与感官能力(如嗅觉、味觉、温湿度感应)有关。可在植物根部与线虫初始接触过程中采取措施进行预防,因此了解寄生虫宿主互作机制具有重要意义。过去大部分研究集中在线虫侵染宿主后不同阶段的转录组学分析,而没有关于侵染前(早期接触阶段)互作机制的探讨。今年11月3日中国农业科学院作物科学研究所的老师们在Scientific Reports 发表了一篇关于小麦和禾谷胞囊线虫在接触早期转录响应机制的研究,填补了国内外研究空白,第一次对小麦和禾谷胞囊线虫互作早期转录组响应进行了系统性的描述。   材料和方法 实验组:Wenmai19小麦幼苗(根长2–3 cm )与J2s;对照组:仅Wenmai 19小麦幼苗或仅J2s。 处理3h后提取RNA测序。实验组小麦根尖染色镜检。每组三个重复。测序后分别对小麦和线虫DEGs进行了鉴定注释,并对线虫的效应基因进行了预测及BT-PCD验证。 测序平台:百迈客HiSeq4000测序平台 分析平台:百迈客云平台(BMKCloud) 研究结果: 1.转录组分析采样时间点确定 CCN易感小麦品种Wenmai19吸引禾谷胞囊线虫J2s。小麦根尖周围聚集的J2线虫数量在3h达到峰值,且J2s未渗入根内部。选择此时小麦根、线虫样品进行转录组分析。 2.小麦根尖转录组数据 实验组、对照组小麦根尖样本共得到52.23 Gb的clean reads,每个样本≥8.25Gb,Q30≥90.4%。每个样品的clean reads与小麦参考基因组比对效率为64.0%至67.3%,并与唯一或多基因组位置匹配(表1)。小麦转录组中,共发现109,496个unigenes,包括9152个新基因。与Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG等数据库比对后,共注释了6,780个新基因。数据重复性较好。 表1 小麦参考基因组比对结果 3.小麦基因表达响应分析 实验组、对照组基因表达分析得到93个差异表达的unigenes(66个下调,27个上调),FDR<0.05和FC≥1.5(图1)。对12个DEGs进行了qPCR验证,其中11个DEG的表达模式与mRNA测序结果一致。结果表明即使未受感染,J2线虫在小麦根部聚集也会触发小麦的响应。 图1 实验组对照组小麦DEGs的火山图 功能注释的结果表明,所有的DEG都能与Nr数据库比对上,其中一些在Swiss-Prot、GO、KEGG、COG数据库中也有注释信息(表2)。 表2 小麦与禾谷胞囊线虫的DEGs的功能注释 GO富集分析将小麦DEGs分为28个功能组,归为3大类:生物学过程(60个)、细胞成分(54个)、分子功能(68个)(图2a)。 图2a小麦根尖unigenes 和DEG unigenes的GO分类 在生物过程类别中,与所有小麦根的unigenes相比,大部分DEG与代谢过程、单一生物过程、对刺激的反应相关。细胞成分类别中更多DEGs位于细胞外区域。 在分子功能类别,与所有unigenes相比,DEG更多富集于营养储存活性,抗氧化活性,电子载体活性,酶调节活性和催化活性等GO分类。 KEGG通路分析来确定DEGs的生物学功能。将31个DEG分配到21个KEGG通路(图3a)。最多数量DEGs归类于苯丙素生物合成通路,其次是谷胱甘肽代谢,苯丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢。6个DEG与苯丙烷相关通路有关,在线虫侵染的小麦根中全部下调,其中两个基因Traes_1AS_F9013A945和Traes_2AS_EE549925C,经qPCR验证有相似的表达模式。 图3a.小麦根尖DEGs的KEGG分析 COG注释后,小麦29个DEGs被分为6个COG功能类别,包括能源产生于转换;次级代谢物合成运输和代谢;仅一般功能预测;翻译后修饰、蛋白质转换,分子伴侣;氨基酸转运代谢;碳水化合物转运代谢(图4a)。 图4.DEGs的COG功能注释 a 小麦根系 b禾谷胞囊线虫 4.小麦DEGs生物胁迫通路图谱 MapMan分析显示小麦许多DEGs能比对到生物胁迫通路(图5):29个小麦DEGs能和生物胁迫通路相关的33个数据点比对上,DEGs包含过氧化物酶,谷胱甘肽S转移酶,激素信号传导(生长素和茉莉酸),发病相关蛋白和次级代谢物。这些DEGs大多数在生物胁迫通路中表达下调。qPCR分析其中8个DEGs,除一个之外,其他的表达模式与测序结果一致。 图5.小麦DEGs生物胁迫通路 在氧化还原反应通路中,3个DEGs与过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶通路比对上,且全部下调,表明氧化还原反应减弱。在激素信号传导通路中,生长素和茉莉酸(JA)通路各包含2个下调的DEGs。 有7个数据点与6个下调的DEGs比对上,几乎都与苯丙素类黄酮代谢通路有关。编码PR蛋白的防御基因有3个下调的DEG,1个下调的DEG,与细胞壁蛋白比对上,1个表达上调的DEG与细胞壁修饰通路有关。 2个下调的DEG,2个上调的DEG可比对到蛋白酶和泛素相关蛋白水解通路。 1个上调的DEG与突发性呼吸相关,隶属乙烯应答元件结合蛋白家族的转录因子,可比对到Traes_5DL_41E3B1B23基因,是一个上调DEG(注释ERF071)。 5.CCN的转录组数据 实验组、对照组CNN样本得到30.47Gb的clean reads,每份样本≥4.13Gb,Q30≥89.1%。共得到194,662个转录本和80,124个unigenes(表3)。unigenes的总长、N50长度、平均长度分别为61,659,712bp,955bp、769.55bp。长于1 kb的unigenes有15,197个。每个CCN样本与组装数据的比对效率在73.2%至79.2%之间。根据Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam数据库,共注释了43741个unigenes。CCN样本重复性良好。 表3 禾谷胞囊线虫的组装转录本及unigene一览 6.CCN基因对于小麦根吸引的响应分析 实验组、对照组CNN比较得到879个DEGs(FDR <0.01和FC≥2)。867个上调,仅12个下调。对10个DEG的表达模式进行qPCR验证,结果与测序结果一致。表明CCNs通过小麦根的刺激激活,大部分基因上调。 DEGs的功能注释,GO富集分析把258个DEGs归类到三大类的36个功能组中:生物过程(159个)、细胞成分(107个)、分子功能(223个)(图2b) 图2b 禾谷胞囊线虫unigenes 和DEG unigenes的GO分类 KEGG分析将247个DEGs归到125个KEGG路径,50个最显著的通路中,核糖体通路有最多的DEG数(64个)(图3b),其他DEG较多的通路为细胞色素P450外源物代谢,谷胱甘肽代谢和Toll样受体信号通路。表明CNN被小麦根部吸引时CNN的蛋白翻译更活跃。 图3b.禾谷胞囊线虫DEGs的KEGG分析 共386个DEGs归类于22个COG功能类别。前四个DEG数目最多的COG类别为仅一般功能预测(90个);翻译,核糖体结构和生物起源(65个);能量产生与转化(45个);氨基酸转运代谢(44个)(图4b)。 7.CNN效应基因预测 搜集PPNs的351个已知效应子基因序列,并将CCN的DEGs与这些序列进行比对。推测6个DEG与已知效应基因14-3-3,几丁质酶,β-1,4-内切葡聚糖酶,果胶酸裂解酶或组织蛋白酶具有同源性(表4)。比对上的效应基因的描述和DEG的Nr注释一致。对这些DEGs结构域进行了预测,结果也与基因描述一致(图6,表4)。当J2线虫与小麦根接触时,编码候选效应蛋白的DEGs全部上调。 表4.根据禾谷胞囊线虫DEGs预测的效应基因 图6 禾谷胞囊线虫的6个候选效应基因的结构域 8.效应基因的植物防御抑制验证 选择两个预测的效应基因c68622.graph_c0和c72543.graph_c0,在本氏烟草中进行程序性细胞死亡(BT-PCD)抑制来验证其抑制植物防御的能力。 BAX加入后,在c68622.graph_c0,没有明显坏死,而c72543.graph_c0则明显坏死(图7)。BT-PCD抑制试验的两个重复结果一致。表明前者抑制BT-PCD,而后者不抑制。c68622.graph_c0是来自H.avenae DEGs的候选基因,可能在抑制植物防御中发挥作用。 图7.(a)c68622.graph_c0和(b)c72543.graph_c0在本氏烟草中BT-PCD的试验 结论: 本文拟研究在线虫与小麦根部在早期接触阶段的相互作用机制,通过mRNA测序对小麦和禾谷胞囊线虫在接触早期的转录组响应进行了分析,鉴定了的宿主小麦根部的93个DEGs(27个上调,66个下调),寄生线虫的879个DEGs(867个上调,12个下调)。其中一些小麦DEGs(主要是下调的)与生物胁迫途径相关,线虫DEGs中几个推定的效应基因表达上调,线虫的几丁质酶样效应基因能抑制本氏烟草中BAX引起的细胞程序性死亡。以上结果表明,在寄生初始接触阶段,线虫的响应比小麦更活跃。寄生虫的响应主要与基因(包括至少一个抗植物防御效应基因)的上调相关,而宿主响应主要与某些防御基因下调相关。     创新点: 第一个对小麦和禾谷胞囊线虫互作早期转录组响应进行系统性描述的研究。 参考文献: Chen C, Cui L, Chen Y, et...