通过转录组研究合浦珠母贝异种异体移植大珠母贝的免疫抑制反应

Transcriptome analysis of the immune reaction of the pearl oyster Pinctada fucata to  xenograft from Pinctada maxima

杂志:Fish & Shellsh Immunology

影响因子:3.148

PMID: 28606863

    1. 研究背景

    大珠母贝(P. maxima)通过同种异体移植的方法进行培养面临很大的困难,而对于合浦珠母贝(P. fucata)而言,同种异体移植培养较容易实现。如果合浦珠母贝可以作为孕育受体去培养大珠母贝珍珠,将有益于大珍珠培养产业的发展。移植后的免疫抑制反应是阻碍该产业前行的一大障碍。据前期的研究统计,珠母贝通过异种异体移植的存活率约在6.3%-15.4%之间。人体器官异种异体移植的免疫反应已有相关报道;在软体动物中,异种异体移植的免疫抑制反应也有报道;但是在珠母贝免疫反应研究中,仅有一项通过转录组技术对珠母贝同种异体移植免疫抑制反应的研究。

    1. 研究目的

    此项研究希望通过转录组技术对合浦珠母贝异种异体移植后免疫分子变化进行探索,寻找对抗宿主珠母贝免疫抑制反应的策略。

    1. 材料方法

     3.1实验材料

    大珠母贝,合浦珠母贝

    实验组

    同种组:合浦珠母贝植入合浦珠母贝地幔片

    异种组:合浦珠母贝植入大珠母贝地幔片

    对照:合浦珠母贝

    实验组分别取手术后不同时期的宿主珠母贝(0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h和 96 h)血淋巴, Control组收集宿主珠母贝的血淋巴(0h),共15个样本,分别进行RNA提取。

     3.2测序方法和数据量

    测序平台:Illumina Hiseq 2500 platform

    总计得到107.93Gb的clean reads,平均每个样本7.1Gb的数据。

    3.3分析方法

    所有分析在百迈客云平台完成(BMK Cloud :http://www.biocloud.net/)。

    主要分析:

    a.数据质控 (去接头,去低质量的序列);

    b.利用合浦珠母贝参考基因组进行组装;

    c.与数据库比对(NR、Swiss-Prot 、GO 、COG 、KOG 、Pfam 和KEGG)注释;

    d.差异表达基因分析(GO分析、KEGG通路富集)。

    4.技术路线

5.实验结果

5.1转录组测序结果

分别对14个实验组和1个对照组样本进行转录组测序,测序数值如表1所示,每个样本的Q30都在91.42%以上,GC含量在42.19%和45.38之间。

5.2 差异表达基因分类和功能注释

分别将各个时期(0h、6h、12h、24h、48h、72h、和96h)同种异体移植组(M组)和异种异体移植组(B组)基因表达量进行比对,获得各个时期的差异表达基因,在0h,获得的差异表达基因最多,共2265个,其中1097个上调,1168个下调(FDR﹤0.05,log2 ratio ≥1)。

图1.不同时期差异表达基因

将每个时期的差异表达基因进行GO分类,获得45-49个子分类,根据GO的三大功能类别(cellular component,molecular function和biological process)分析,大多数免疫相关的基因被富集到biological process这一类。

通过KEGG通路富集分析,各个时期的差异表达基因分别富集到148(M0/BO),106(M6/B6),99(M12/B12),92(M24/B24),73(M48/B48),123(M72/B72),和96(M96/B96)个通路中。

5.3异种异体移植引起的免疫相关差异表达基因

为了鉴定这些差异表达基因参与的免疫路径,探索异种异体移植引起的基因表达具体变化,研究人员通过GO富集将各时期的同种移植和异种移植免疫反应相关差异表达基因分成不同的功能类别(P≤0.05),在M0/B0组中,细胞循环,NADH脱氢酶活性等相关基因显著富集,其中一些与免疫学过程相关;在M12/B12组中,有大量的氧化还原过程和调控细胞转移的unigenes,它们可能参与血球细胞的转移和吞噬;通过数据分析得到,48h和72h中,损伤修复是重要的term,它与免疫反应最相关;在96h,细胞凋亡是重要的term。

结合KEGG通路富集分析,在M0/B0的比对中发现,核糖体,氧化磷酸化和GPI锚等相关路径被显著富集。在M6/B6比对中,有9个显著富集的通路,包括细胞凋亡、拼接体和MAPK信号通路等,且大多数通路与免疫功能相关;值得注意的是MAPK信号通路在6h、24h、72h和96h组多次出现并且显著富集。MAPK信号通路和其他免疫相关通路富集,可能是该研究中描述同种异体移植和异种异体移植免疫反应差异的一个好起点。

图2.不同时期差异表达基因GO富集图

通过unigene聚类分析鉴定了不同时间点的免疫相关基因:在0h,参与氧化还原反应的基因(包括NADH脱氢酶1、细胞色素c氧化酶1等)在异种异体移植中上调;在6h,热休克蛋白70、热休克70kDa蛋白等在异种异体移植中比同种异种中表达量高;在12h,NADH脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶在异种移植中高表达;

研究人员通过GOterm分析检测到参与氧化还原反应的表达基因,在24h,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 pak-1在异种异体移植中大量表达;在48h,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和热休克蛋白70在异种异体移植中大量表达;在72h,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 pak-1在异种异体移植组中表现出下调;96h,热休克蛋白70和TNF受体关联因子6继续在异种异体移植中高表达,表明免疫反应依然存在。

图3.不同时期unigene聚类热图

5.4移植引起的差异表达基因鉴定

将两个实验组分别与对照组进行比对后,再将比对后的同种异体移植与异种异体移植进行比对。获得不同时期( 0h/6h/12h/24h/48/72h/96h)的差异表达基因分别为518,814,807,710,689,700,832个。

图4.两实验组与对照组比对韦恩图

通过KEGG通路富集分析,河马信号通路、内质网蛋白加工、 MAPK信号通路、核糖体等通路显著富集。许多基因在实验组高表达,在对照组表达量较低,细胞异常死亡蛋白1和蛋白激酶7在对照组中表达量较高,但是在实验组中几乎不表达,说明这些差异表达基因是由移植引起 。

6.RT-PCR验证

从不同表达水平中随机选择10个与免疫相关差异表达基因进行qRT-PCR实验,实验结果与RNA-Seq结果基本一致,证明了本实验中的差异基因表达谱准确可靠。

图5.RT-PCR验证

7.结论

综上所述,无论在同种移植还是异种移植,免疫抑制都是重要的免疫反应。细胞凋亡、河马信号通路、氧化还原作用、MAPK信号通路、核糖体、内质网蛋白加工、嘌呤新陈代谢、NF-kappa B 信号通路、氧化磷酸化、Ras 信号通路、泛素介导的蛋白质水解参与了移植应答反应。NADH脱氢酶、HSP70、细胞凋亡蛋白酶-7分别在氧化还原反应,MAPK信号通路和细胞凋亡途径表现出不同的表达量。可以推测氧化还原反应很可能是移植后免疫抑制反应中的关键因素。这些发现有助于阐明异种异体移植免疫抑制反应的分子机制,也有益于珠母贝异种移植免疫抑制试剂的开发。

8.创新点

通过珍珠贝同种移植和异种移植差异表达基因的比较研究,寻找异种异体移植免疫抑制中的关键影响因素,开辟了珍珠贝异种异体移植研究的新方向。

 

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