【成功案例】比较转录组分析和形态学对杏品种(Prunus armeniaca L.)的内果皮发育缺陷的研究

研究背景:

杏(P.armeniaca)属于蔷薇科中常见的一种核果,全世界范围内分布广泛,具有较高的营养价值,富含膳食纤维、有机酸、维生素C、胡萝卜素、微量元素等。 木质化的内果皮(endocarp)在包括杏在内的许多具有较高经济价值的核果(drupe fruits)种子发育过程中发挥着非常重要的作用,为种子提供了安全的发育环境,避免了直接暴露于各类害虫与病原菌。 内果皮木质化是核果成熟的一个重要标志,木质化的过程本质上是植物次生细胞壁形成与木质素积累的过程,在以往其他核果中的研究发现,一些与植物生长发育相关的重要转录因子,比如MYB、NAC、MADs-box,在核果内果皮的发育调控网络中扮演着重要的角色。 本研究以两种不同内果皮表型的两种杏作为实验材料,借助高通量测序来揭示杏内果皮发育背后的分子调控机制。

材料与方法:

测序材料:

LE品种杏 内果皮薄、柔软、韧性高 JG品种杏 内果皮厚、坚硬、韧性低 取样部位: 去核果实 测序平台: Illumina HiSeq™ 2500 PE125测序

技术路线:

结果–LE、JG品种杏内果皮表型观察比较

a)如图2所示,两种品种杏的果实具有相似的发育模式,a1、b1、c1是以开花后时间(DAFB)为横坐标,分别以果实重量、果实长度、果实宽度为纵坐标做图,两种杏的果实均呈现出了“双S曲线”生长模式,图a2、b2、c2是分别对a1、b1、c1一阶导数作图,两种果实同样也表现出相似的趋势。 根据生长曲线,研究者将果实的发育划分为4个时期:第一次指数生长期(before 30DAFB)、缓慢生长期(30-49DAFB)、第二次指数生长期(49-83DAFB)、成熟期(after 83DAFB)。

b)图3展示了两种品种杏的内果皮在果实发育的不同阶段各项指标的比较,包括内果皮木质素含量(图3d)、内果皮厚度(图3e)、内果皮界面面积(图3c)、内果皮木质素积累直观观察(图3b)、内果皮显微镜直观观察结果(图3a)。 图3a显示,LE品种与JG品种的内果皮在15DAFB之前形态上基本无差异,15DAFB之后,LE品种的内果皮开始出现破裂缺失,随着发育阶段往后推移,破裂程度越来越大。 图3e显示,LE品种与JG品种的内果皮在30DAFB之前厚度上并无差异,之后在厚度上,两种品种出现显著差异。 图3d显示,LE品种与JG品种的内果皮中木质素含量也在24DAFB之后出现显著差异。

综合以上表型观察结果得出,LE品种与JG品种的内果皮发育过程以及内果皮木质素含量存在显著差异。

 

结果–mRNA测序与转录本组装

a)测序取样部位 : 去核后的果实,每个品种两个生物学重复 测序取样时间点 : 根据上一部分的表型观察结果,LE品种内果核在15DAFB时出现裂缝,在24DAFB时,裂缝程度开始快速增大,因此,该mRNA测序项目选择了15DAFB和24DAFB两个时间点样本 b)转录本组装:测序共得到~20Gbase clean data,使用Trinity软件组装得到63,170条unigene,unigene N50大小1689bp,详细组装结果参见表1。

结果–unigene功能注释

a)基于blast比对,63,170条unigene中有25,356可比对到日本杏(Japanese apricot)与桃(peach)基因组数据库。 b)使用BLASTx(e-value阈值设为10e-5)将上述25,356条unigene比对到NR, Swiss-Port, GO, COG, KOG ,kegg数据库以进行功能注释,每条unigene均有多条注释,详细的注释结果统计信息请参见表3. c)GO数据库注释过程中,16,506条unigene被注释到,其中, ‘metabolic process’ (8408 genes, 50.93%)是被注释到最多的GO 条目;KEGG数据库注释过程中,4830条unigene被注释到了118个代谢通路。大部分的unigene被注释到了‘carbohydrate metabolism’ (905 genes), ‘translation’ (596 genes), ‘amino acid metabolism’ (581 genes), or ‘folding, sorting and degradation’ (471 genes)等代谢通路。

结果–差异表达基因检测

使用DESeq进行了差异表达基因检测,差异表达基因筛选阈值为:FDR<0.01,FC > 2 。15DAFB时间点上,两个品种间检测到差异表达基因2887个,24DAFB时间点上,两个品种间检测到差异表达基因886个,具体上下调、共有特有情况请参见图5.

结果–差异表达基因功能分析

a)LE品种内果皮破裂与发育不全是一个非常复杂的表型,与众多的代谢通路相关,但类苯基丙烷相关通路是众多代谢通路中已经证实的非常重要的一个。该项目中对两个品种在两个时间点的差异表达基因的KEGG富集分析结果也证实了上述事实,所以差异基因显著富集于类苯基丙烷代谢、合成等通路。类苯基丙烷相关通路相关差异表达基因见列表4与图6。

b)一些转录因子也被报道与内果皮发育相关,包括SHP 、 STK、ALC、IND、FUL、RPL、NST1、NST3以及一些MYB家族转录因子。该项目中,SHP, FUL, MYB32 ,STK, MYB46–1, MYB46–2,  NST1 也包含在两个品种间的差异表达基因列表中,也发现了上述部分基因差异表达方向与预期不符。

结果–RT-PCR验证

挑取18个表型相关基因,对测序分析得到的差异表达结果进行了验证,结果显示,两种技术得到的基因定量结果间的pearson相关系数可达到0.9188, P value 小于 0.0001,说明测序分析结果具有较高的可靠性,RT-PCR定量结果参见图8。

结果–共表达分析

a)文章最后,使用K-means聚类对之前得到的差异表达基因进行了共表达分析,分析结果显示:基于表达趋势,所有差异基因可划分为7个cluster,每个cluster内部的基因具有相似的表达趋势,也就可能在细胞内行驶着相似的功能,聚类结果见图7。 b)之前分析得到的内果皮发育相关基因大多分布在cluster1或者cluster6,cluster1中的基因在LE品种中高表达,JG品种低表达,cluster6与cluster1相反。

结论:

1)LE品种杏的内果皮裂缝出现于15 DAFB(开花后15天),裂缝面积也会在之后会越来越大;

2)成熟的LE品种杏的内果皮的厚度及木质素含量分别仅为内果皮正常发育品种JG的60.39%、63.25%;

3)已有研究表明与内果皮发育相关的一些转录因子及类苯基丙烷合成代谢相关基因,也包含于该项目得到的差异表达基因列表中;

4)一些转录因子尤其是NST1可能参与调控了类苯基丙烷相关代谢通路;

 

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