【成功案例】油菜分枝角度转录调控研究

题目:mRNA-miRNA整合分析揭示BR、auxin信号通路参与调控油菜分蘖(分枝)角度

发表杂志:Int J Mol Sci  影响因子:3.226

研究背景

油菜是全球范围内非常重要的一种油料作物,随着人口的增加与可用耕地面积的减少,最大限度提高包括油菜在内的各类作物的产量成为了育种学家考虑的一个重要问题。增大单位土地上的种植密度是一种增加作物产量的策略,每棵植物生长所需的地上面积主要由侧枝的数量、长度与着枝角度决定,这些因素中,对侧枝及叶子着枝角度的研究对于植物的高密度种植策略的应用具有重要的意义。

在以往的研究中已经发现,水稻中的LAZY1,、TILLER ANGLE CONTROL1、PROSTRATE GROWTH1、 LOOSE PLANT ARCHITECTURE1基因,玉米中的ZmTAC1、ZmLAZY1基因,拟南芥中的 AtLAZY1 、 AtLPA1基因均参与调控了叶子或侧枝的着枝角度。在代谢物水平,通常认为叶或枝的着枝角度与植物生长素( auxin)、油菜内脂素(Brassinosteroids,BR)的在组织中的不均匀分布有关系。

在植物中,一些microRNA也被发现与auxin调控网络或者分蘖角度相关,比如,miR393通过auxin调控网络影响叶与根的形态结构;miR164可降解转录因子NAC1转录本,从而下调植物对auxin的响应水平,抑制植物侧根的发育;auxin响应基因ARF8、ARF6在大部分物种中被miRNA167调控;水稻中,过表达miR160,水稻分蘖角度增大。

目前,油菜中对分蘖角度的研究还比较少,本研究组之前基于F2群体,使用BSA混池性状座位定位策略,鉴定到了一个与auxin合成相关,且可能参与了侧枝着枝角度调控的基因BnaYUCCA6。

该研究通过对分枝角度有显著差异的两种油菜品系进行mRNA与microRNA高通量测序,来进一步探讨油菜中与分蘖角度相关的分子调控机制。

 

材料与方法

材料:

油菜品系6098B(较大分枝角度,约52度)

油菜品系Purler(较小分支角度,约22度)

方法:

测序类型:mRNA、microRNA高通量测序

测序平台:illumina Hiseq 2000测序平台

取样方法:两个品系的均取抽薹时期与花发育早期两个时间点的分枝发生部位。每个品系每个时期1个样本(每个个体至少取5个分枝发生部位,最多6个个体混样样本),总共4个样本,每个样本分别进行mRNA测序与microRNA测序

数据分析平台:百迈云数据分析平台(http://www.biocloud.net/

Figure 1

技术路线

结果:mRNA测序与分析

a)每个样本测序得到~6Gbase 可用数据,与参考基因组比对率~80%。

b)差异表达基因筛选(EBseq,FDR < 0.05 & |FC|>2):如图2A所示,抽薹期,两个品系间检测得到5908个差异表达基因;花发育早期,两个品系间检测到5397个差异表达基因。其中3261个为两个时间点共有差异表达基因。

c)对上述3261个共有差异表达基因进行GO功能分析,如图2B所示,差异基因在biological adhesion、biological phase、and locomotion、 macromolecular complex、cell junction、and nucleoid 、nuclear and protein binding transcription factor activity and receptor activity等GO term上有显著富集。

d)对两个时间点所有差异基因进行KEGG通路分析,其中3297个基因注释到了KEGG数据库 ,其中大多数基因注释到了 ribosome 、oxidative phosphorylation相关代谢通路。值得注意的是,在两个时间点分别有58、51个差异基因注释到了植物激素信号通路,进一步分析发现,这些通路大多为BR或auxin信号转导通路。该部分结果如图3所示。

Figure 3

e)图4展示了在BR生物合成、BR信号转导通路、auxin信号转导通路上鉴定到的差异表达基因。这些差异基因中,BR6OX调控了BR生物合成过程中multiple C-6C的氧化过程;DWRF1催化24-methylenecholesterol转化为campesterol,该过程为BR生物合成的第一步;分布在BR信号转导通路上的差异基因包括 BRI1, BSK, BZR1, and CYCD3等, 这些基因多在品系 Purler中下调 (见图 5E);分布在 auxin 信号转导通路上的基因包括 AUX1, IAA, GH3, ARF等,其中 IAAs, GH3s,  ARFs 在两个时间点的 Purler品系材料中均表现为上调。

结果:miRNA测序与分析

a)每个样本测序得到~7M  可用reads,长度分布在18nt到30nt之间。

b) 鉴定得到202个 microRNAs, 包括 85 个miRbase注释的已知microRNA, 111 具有稳定发卡前体结构的新型 microRNA。

c) IDEG6软件分析( |FC| >2)进行差异表达分析,两个时间点在两个品系间分别检测得到45、65个差异表达microRNA。值得注意的是,如图7所示,除了miR1140 与miR827, 抽薹时间点上的所有已知 差异表达miRNAs 均在 品系Purler中上调,这其中包括3个miR156 家族 与6个 miR395 家族microRNA,相反,花发育早期时间点上的所有差异表达miRNAs 均在 品系Purler中下调。

e)为了分析差异表达microRNA的生物学功能,使用TargetFinder软件对所有差异表达microRNA进行了靶基因预测,得到的一些靶基因参与了分枝角度调控,比如,  miRX215的两个靶基因与拟南芥中  organellar (peroxisome, glyoxysome) 3-ketoacyl-CoA thiolase编码基因同源; miRX115.1 的3个靶基因与拟南芥中 ATP-dependent caseinolytic (Clp) protease编码基因同源。

结果:miRNA-mRNA联合分析

大部分的miRNA与其对应的靶基因在表达量上均呈负相关,比如, miR156 在Purler品系中转录上调, 其对应的大部分的 靶向 SPL 基因在Purler品系中表现为下调;  miR395 与miR319 在Purler品系中转录上调 ,其对应的靶基因包括 Sulfate Transporter (SULT) 、TEOSINTE-BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF (TCP)表现为相反的趋势,这些结果说明,本研究中的mRNA-seq、microRNA-seq结果均比较可靠。转录水平表现为相反趋势的的miRNA-gene 可用于后期进一步更加深入的挖掘油菜分枝背后的microRNA-mRNA调控网络。

 

结论

鉴定得到了一些分布在BR、auxin生物合成或者是信号转导通路上的差异表达基因与microRNA,这些基因或者microRNA可作为与油菜分枝角度调控相关的潜在基因集,为后续更加深入的相关分子学机制研究提供了数据支持。