11月14 【成功案例】小黑杨WRKY70基因在盐胁迫和叶枯病响应中的作用
Populus simonii × Populus nigra WRKY70 is involved in salt stress and leaf blight disease responses
小黑杨WRKY70基因在盐胁迫和叶枯病响应中的作用
杂志：Tree Physiology
影响因子：3.653
PMID: 28369503
研究背景：
WRKY超家族是重要的植物转录因子(TF)家族成员，其DNA结合域有保守的N端WRKYGQK七肽。WRKY蛋白可特异性识别结合靶基因启动子的顺式元件(CE)，w-box(TTGACC/T)。过去20多年的研究表明WRKY是多种生物学过程（如种子休眠/萌发、衰老、发育和生物/非生物胁迫响应）信号网络的关键节点。WRKY蛋白通常会激活或抑制植物的转录调控过程，一些WRKYs甚至同时具有激活和抑制作用。一种WRKY 转录子也可调节几个不同生物学过程。
植物常受到各种生物/非生物胁迫。盐和病原体胁迫是常见的环境刺激，盐胁迫会影响离子渗透压平衡，排毒及生长调节过程。菌类胁迫会使植株产生叶斑，腐烂和枯萎。植物进化出精细响应调节机制来适应这些胁迫，许多TFs是生物/非生物胁迫信号响应网络中重要的调控点。WRKY蛋白作为一种重要的胁迫响应TFs，参与了广泛的生物和非生物胁迫响应过程。
小黑杨在中国北方分布广，这种杂交白杨生长迅速，能很好地适应高盐，寒冷，干旱和贫瘠的环境，因此是一种研究木本植物胁迫响应机制的理想材料。我们既往转录组分析结果表明，在小黑杨受到链格孢侵染或在盐碱、干旱和重金属胁迫下PsnWRKY70基因的表达量发生显著变化。我们推测PsnWRKY70基因可能在小黑杨生物/非生物胁迫响应调控网络中发挥重要作用。既往在WRKY蛋白的生物功能方面的研究进展较多，但关于调控机制的阐述有限。因此进一步研究PsnWRKY70转录子在小黑杨胁迫响应调控网络中的作用具有重要意义。
材料和方法
材料：小黑杨
培养条件：
盐胁迫实验：在25-32℃温室，自然光照条件下，140mM的NaCl溶液处理
叶枯病胁迫实验：条件为:白天/晚上气温，25℃/20℃;湿度,50-60%;光周期,16小时光/8小时黑暗;光合光子通量，150 μmol m-2 s-1。
处理组：
.盐胁迫实验组：2个月月龄的NT，OEX和REX植株每隔三天用140mM的NaCl溶液处理。
叶枯病胁迫实验组：2个月月龄的NT，OEX和REX植株喷洒链格孢菌孢子悬液。在处理前(0 h)和处理后36 h收集第三至第五功能叶片用于提取RNA。分别在0天，处理后3、6、9、12天收集第六到第八个功能叶用于MDA含量测定。
对照组：用水处理，所有样本三个重复。
转录组分析:在叶枯病抗性分析培养条件下培养的NT、OEX1和REX1的植株，长到30厘米后用140 mM的NaCl溶液处理。收集盐胁迫36小时后的第五个功能叶(两个重复)
测序平台：百迈客高通量测序平台Illumina HiSeq 4000
分析平台：百迈客云平台（BMKCloud）主流程和小工具
方法：
本文拟研究小黑杨的生物/非生物胁迫响应调节网络。进行了下列实验：
- 启动子克隆及序列分析：为全面了解PsnWRKY70基因的生物学功能，对PsnWRKY70启动子进行克隆，并对启动子CEs进行了生信分析，预测了PsnWRKY70的转录起始位点（TSS）并进行PCR验证。
2.酵母单杂交筛选和验证：进行了酵母单杂交筛选来研究PsnWRKY70基因的上游调控子，并对PsnWRKY70，PsnMYB，PsnNAM和PsnGT1蛋白质与PsnWRKY70基因启动子互作关系进行分析。
3.PsnWRKY70基因序列和表达分析：对PsnWRKY70基因开放阅读框和保守域进行预测，确定了PsnWRKY70 TF的物理化学参数，预测了亚细胞定位。并与TAIR和RGAP数据库部分拟南芥和粳稻的Group III WRKY TFs序列进行多重序列比对(ClustalW）构建得到不同物种32种WRKY蛋白的系统进化树（MEGAver.6.0）。
4.基因克隆、遗传转化和验证：克隆了PsnWRKY70的开放阅读框架(ORF)并融合到绿色荧光蛋白(GFP)中，OEX和REX载体通过农杆菌介导的叶片转换法将重组子转移到小黑杨中。并进行了PCR、Northern blot、表达量水平的验证。
5.胁迫分析：根据表型、损伤指数、丙二醛(MDA)含量和基因表达模式对转基因和非转基因(NT)组的盐胁迫耐力和叶枯萎病抗性进行评价和比较。
6.转录组分析：为进一步确定了PsnWRKY70 转录子的盐胁迫反应调节机制，选择盐胁迫处理的转基因和NT叶片作为样本进行转录组测序和分析。
研究结果：
1.启动子分析和酵母单杂交实验
克隆了2471bp的PsnWRKY70基因的启动子序列，分析显示提示许多胁迫响应CEs存在于PsnWRKY70的启动子区域，这些CEs中,W-box(TGAC)和GT1元素(GAAAAA)是高度富集的，酵母单杂交筛选结果显示，有五个基因(PsnBTB/POZ、PsnCCD1、PsnZFP、PsnWRKY70、PsnFP)可与W-box及其相邻序列结合，同时七个基因产物(PsnNAM、PsnDDS1、PsnMYB、PsnLHTP、PsnGT1、PsnETIF6-2、PsnAPD）可与GT1元件和其邻近序列结合。
为进一步证实PsnWRKY70 /PsnMYB / PsnNAM /PsnGT1蛋白与相应CEs的互作关系，将报道载体(pCAM-Wr/Wm/Gr/Gm) 和效应载体(pROKII-W70/MYB/GT1/NAM)共转移到烟草叶片中，GUS/LUC相对活性实验表明：在盐胁迫条件下PsnWRKY70可特异性结合W-box,而PsnMYB、PsnGT1、PsnNAM可特异性结合GT1元素。
2.PsnWRKY70基因序列分析和表达分析
PsnWRKY70的ORF长度为966bp,编码321个氨基酸的蛋白质。单WRKY域和Cx7Cx23HxC-type锌指状模体表明PsnWRKY70 TF是Group III成员。PsnWRKY70蛋白化学式可能的是C1553H2405N445O513S16,理论pI 为5.72，分子量为36.03 kDa。亚细胞定位显示PsnWRKY70存在于细胞核的可能性最大。多序列比对结果显示PsnWRKY70与拟南芥和粳稻的Group III WRKY TFs一致(图1)。系统发育分析结果表明PsnWRKY70和胡杨WRKY70具有高同源性(XP_011001689.1)(图2)。qRT-PCR 检测PsnWRKY70在小黑杨不同组织种表达水平不同，在叶中高表达,根和茎中低表达，因此选择叶片作为材料进行后续实验。
图1多重序列比对（红盒框内序列为保守WRKY域,蓝框内氨基酸残基为锌指模体。）
图2系统发育分析：来自不同物种的WRKY蛋白质系统发育树,红色标识的蛋白质为PsnWRKY70 TF
3.PsnWRKY70 转基因植株的培育和验证
为进一步研究PsnWRKY70 基因在不同胁迫中的生物学功能，通过转基因实验，构建小黑杨PsnWRKY70基因过表达和抑制表达的转基因植株，并在转基因和NT植株中进行了胁迫响应分析。得到了8个OEX植株和10个REX植株并通过gDNA PCR、Northern blot、基因表达水平结果进行了验证。
4.转基因植株和NT植株的盐胁迫和叶枯病胁迫响应
数据显示在正常生长条件下REX植株(REX1-REX3)一般都比OEX(OEX1-OEX3)和NT植株高(表1和2)。
在盐胁迫下,REX植株的RHGRs明显大于NT和OEX。此外,在所有盐胁迫处理的植株中,REX1有最大的RHGR(0.296±0.008),而OEX2是最小的RHGR(0.199±0.011)(表1)。在病菌胁迫下，REX往往比NT和OEX生长慢。OEX3的RHGR最大(0.264±0.019)REX1的RHGR最小(0.154±0.012)。(表2)。
表1盐胁迫下的OEX、REX和NT植株的HG
表2叶枯病胁迫下OEX、REX和NT植株的HG
叶盐损伤指数表明,OEX比NT和REX损伤更大。而叶病指数表明,REX比NT和OEX叶疾病症状更严重。此外,REX2叶盐害指数最小(52.06%±1.34%),OEX2叶枯病指数最小(27.30%±1.50%)(图3a-d）。
图3 OEX、REX和NT植株的表型观察、叶盐损伤指数/疾病指数和MDA含量分析。(a，b)在高盐和病原体的胁迫下表型观察结果;NT-L、OEX2-L和REX1-L表示NT、OEX2和REX1的第9-12个功能叶。(c,d)
OEX、REX和NT的叶盐损伤指数和叶病指数。不同列字母标记的表示不同的line间有显著差异(e，f)OEX、REX和NT在盐和病原体胁迫下MDA含量。
脂质过氧化作用终产物MDA是一个重要细胞膜损伤的生化标记。一般来说,在盐和病菌胁迫时OEX、REX、NT植株中MDA含量大大增加(图3e和f)。三天盐胁迫处理后,OEX的MDA水平显著高于NT和REX(图3e)。真菌感染三天后,NT和REX的MDA含量高于OEX(图3f)。值得注意的是,在盐胁迫时OEX2有最大的MDA增幅，而在病菌胁迫时MDA增幅的最小。(图3e和f)
为研究在盐和病菌胁迫下PsnWRKY70的表达模式，进一步验证酵母单杂交分析的结果，对PsnWRKY70，PsnNAM，PsnMYB，PsnGT1基因进行了qRT-PCR 验证。结果显示,在NT中，盐胁迫处理36小时后:PsnWRKY70和PsnNAM轻度下调(FC < 2)，而PsnMYB和PsnGT1持平;在OEX2中PsnWRKY70,PsnMYB，PsnGT1明显下调(FC≥2);在REX2中PsnMYB(2.03倍)和PsnGT1(1.32倍)上调，PsnWRKY70和PsnNAM持平。在叶枯病响应中:NT和REX1的四种基因都表达明显上调，在OEX2中，PsnNAM和PsnMYB几乎不变,PsnWRKY70和PsnGT1显著下调。聚类分析表明NT植株在盐胁迫和病菌胁迫下PsnWRKY70、PsnNAM， PsnMYB， PsnGT1表达模式相似(图4)。
图4 盐胁迫、病菌胁迫下NT和转基因line的表达变化趋势的聚类分析
5.NT、OEX1，REX1的转录组分析
测序矫正后得到141.4MB的clean reads，每个文库20-30MB,Q30≥94.45%，约12.5-18.1MB数据可比对到毛果黄肉楠杨树基因组，与NT相比，OEX1中有517个DEGs（338个上调，179个下调），盐胁迫下REX1中有70个DEGs（27个上调，43个下调）(图5)
在所有DEGs中有许多上调或下调的MAPK级联成员，GO分析结果显示与莽草酸酯生物合成，分支酸合成，细胞程序性死亡负调控，真菌抗性，水杨酸合成相关的GO terms在OEX1中显著富集，而在REX1显著富集的是与抗旱响应，尿素跨膜运输、脱落酸响应，钙离子运输和过氧化氢跨膜运输相关的GO terms。KEGG富集揭示与苯丙氨酸代谢，过氧化物酶体，植物病菌互作，以及芳香族氨基酸的生物合成，次级代谢，苯丙烷类和氨基酸的相关的DEGs在OEX1中显著富集，在REX1中富集到与嘧啶、醚脂代谢途径以及泛醌，类萜醌，芳氨酸、角质、软木脂、蜡生物合成相关的DEGs。OEX1中富集到的生物过程中，竟有一些疾病抗性相关的通路。这些通路主要与以下DEGs相关：Potri.013G153400,Potri.009G082900、Potri.004G089400 Potri.017G126200,Potri.002G216800和Potri.003G150200
图5 NT/REX1和NT/OEX1间的DEGs的维恩图。红色绿色分别是上调和下调的基因
研究结论：
此研究中，我们鉴定并克隆了PsnWRKY70基因和启动子，用酵母单杂交分析来检测上游调控子，胁迫响应分析显示OEXs比NT有更强的叶枯病抗性，REXs比NT有更强的盐耐力，NTvsOEX1的DEGs与NTvsREX1的DEGs展现了巨大的差异，基于NT和OEX1的DEGs预测PsnWRKY70 TF的潜在靶基因。总结如图6，PsnWRKY70 TF的胁迫响应信号机制未完全阐明，有待进一步研究。
图6 对PsnWRKY70 TF的高盐胁迫/叶枯病胁迫响应信号转导途径的图解（上游调节因子(PsnBTB/POZ, PsnCCD1, PsnZFP, PsnWRKY70, PsnFP, PsnNAM, PsnDDS1, PsnMYB, PsnLHTP, PsnGT1, PsnETIF6-2 and PsnAPD) 通过特异性结合w-box或GT1元件调控PsnWRKY70基因的表达，在植物细胞环境下，进行了 PsnWRKY70, PsnNAM, PsnMYB and PsnGT1蛋白(红色标记的)与w-box和GT1元件结合的活性和特异性的验证。HP1、RRM Ulp1和一些MAPK级联成员与PsnWRKY70 TF相互作用，参与到盐胁迫响应网络中;预测的PsnWRKY70 TF的靶基因列于虚线框中）
创新点
本研究构建了REX,OEX重组子导入小黑杨中。根据表型、损伤指数、丙二醛(MDA)含量和基因表达模式对转基因和非转基因(NT)组的盐胁迫耐力和叶枯萎病抗性进行评价和比较，并进行了生物学功能及信号传导通路相关探讨。不仅揭示了PsnWRKY70基因的盐胁迫响应信号转导途径，也证实小黑杨的PsnWRKY70转录因子在盐胁迫和叶枯病的反应响应中的生物功能，有助于我们了解小黑杨的生物/非生物胁迫响应调节网络并进行后续深入研究。