11月16 猪植入前胚胎发育过程中基因间长链非编码RNA的鉴定和功能分析

发布于 10:25 作者： bmk

PMID: 27922056

杂志：Scientific reports

影响因子：5.228

 

研究背景：随着高通量RNA-seq技术的发展，已经在许多物种中鉴定出了大量的基因间长链非编码RNA（lincRNAs）。有研究表明，一些lincRNA在植入前胚胎发育（PED）过程中发挥重要作用。猪是一种理想的生殖和生物医学应用研究模型，然而对猪lincRNAs的研究还比较欠缺，因此需要对lincRNAs进行全面的全基因组范围鉴定。此外，合子基因组激活（ZGA）对成功的移植前胚胎发育至关重要，因此需要对ZGA的具体分子机制进行研究。目前很少有研究报道猪PED中转录组的变化情况，对PED中lincRNAs的功能研究还很有限。

公共数据获取：

从NCBI-SRA数据库中下载得到五个猪RNA-Seq数据集，Supplementary Table S1中列出了RNA-seq数据编号和详细信息。

Supplementary Table S1 Details of RNA-seq data

技术路线：

实验结果：

1.基于猪RNA-seq数据集的lincRNAs鉴定

本文利用5个包含猪各种组织或细胞的RNA-seq数据（Supplementary Table S1）对linckRNAs进行了全面鉴定。经reads mapping和转录本组装后从122,007个基因座鉴定出了195,531个转录本。排除已知mRNA并进一步筛选后获得了7,618个lincRNA。

2.猪lincRNA的结构特点

作者对预测获得的lincRNAs和Ensemble中记录的mRNAs进行了比较，发现lincRNAs中的外显子明显较少(平均值：lincRNAs 2.97个、mRNAs 8.49 个; Kolomogorv-Smirnov Test, P-value<2.2×10−16)（Fig. 2A）。而猪lincRNAs外显子长度比蛋白编码基因长(平均值：lincRNAs 484bp、mRNAs 307bp； Kolomogorv-

Smirnov Test，P-value<2.2×10−16)（Fig. 2B）。由于较少的外显子数量，整体lincRNA长度小于蛋白编码基因的转录本长度(平均值：lincRNAs 1338 bp、mRNAs 2842 bp；Kolomogorv-Smirnov Test，P-value<2.2×10−16) (Fig. 2C)。

Figure 2. Features of pig lincRNAs.

        3.猪lincRNAs的低表达量和组织特异性

        对不同组织和细胞系中lincRNAs的表达模式分析结果显示lincRNAs与蛋白编码基因相比表达量较低。为了定量评估每个转录本的表达特异性，作者应用依赖于Jensen-Shannon（JS）距离算法的基于熵度量法计算每个转录本的表达特异性。结果显示，lincRNAs比蛋白编码基因表现出更高的JS平均值（Fig. 3B），这说明lincRNAs比蛋白编码基因有更高的组织特异性。

Figure 3. Characteristics of pig lincRNAs expression.

        4.lincRNAs与邻近蛋白质编码基因之间潜在的顺式作用关系

        研究表明，lincRNAs可能通过正、负两种方式调节邻近蛋白编码基因表达。通过GO分析发现猪lincRNAs的邻近蛋白编码基因被富集到“转录调控”功能。对lincRNA与邻近蛋白编码基因的转录起始位点（TSSs）距离的分析发现了462个TSSs距离在4kb以内的lincRNA:mRNA对。值得注意的是lincRNA:mRNA对中32%的lincRNAs始于400nt内，而mRNA:mRNA对只有12%（Fig. 3D）。这些结果说明猪的lincRNAs可以顺式调节他们邻近蛋白编码基因的表达。

5.植入前胚胎发育相关lincRNAs的功能分析

过滤除去每个胚胎发育阶段的低方差lincRNAs和mRNAs后,进行了共表达网络分析（WGCNA）探索猪PED过程中lincRNA的作用。通过无监督聚类分析鉴定出了23个共表达模块（Fig. 4A）。其中5个模块显示发育阶段特异性（Fig. 4B），它们可能代表每一个过渡阶段的核心基因网络。为了进一步预测lincRNAs在猪PED过程中发挥的功能，作者对每个阶段特异性模块进行了GO富集分析，发现对应ZGA的4细胞到8细胞转变阶段的模块被富集到转录调控、表观调控和细胞周期条目中（Fig. 4C）。

Figure 4. Function prediction of PED associated lincRNAs.

        6.猪植入前胚胎发育枢纽 linckRNA的鉴定

        为了鉴定猪PED中的枢纽linckRNA，作者利用WGCNA测量了模块内的基因间连接，并提取了每个阶段特异性模块中的前100个枢纽基因。然后在4细胞阶段特异性模块中的枢纽基因集中选取10个lincRNAs进行了qRT-PCR分析，发现这些lincRNAs在生殖组织中作为一个整体表达（Fig. 5A）。研究还发现在卵巢中高表达的两个lincRNAs：tcons_00166370和tcons_00020255 在4细胞阶段显示出明显的激活趋势，而8细胞阶段迅速下调（Fig. 5B）。尽管这些参与猪PED过程的lincRNAs的作用机制还不清楚，枢纽lincRNAs的鉴定为进一步的功能研究提供了宝贵的资源。

Figure 5. The expression of two hub lincRNAs from 4-cell stage-specific module in different tissues and PED.

结论：进行了完整的猪lincRNAs分析，提供了首个猪植入前胚胎发育相关lincRNAs图谱。WGCNA分析显示PED相关lincRNAs与细胞周期调节、转录和表观调控过程有关。对枢纽lincRNAs的qRT-PCR分析发现了两个与PED密切相关的lincRNA：TCONS_00166370 和TCONS_00020255。