05月28 定位+实验验证：Plant Journal | BSA助力黄瓜耐水淹定位解析
Bulked Segregant Analysis（BSA）分析是利用极端性状个体混池快速进行功能基因挖掘的常用方法，广泛应用在植物基因克隆方面。由百迈客和扬州大学陈学好教授课题组合作，利用SLAF-BSA策略定位黄瓜耐淹基因，相关研究成果发表于Plant Journal。
英文标题：The major-effect QTL CsARN6.1 encodes an AAA-ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance through promoting adventitious root formation
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中文标题：CsARN6.1编码的AAA-ATPase基因通过促进不定根形成增强黄瓜耐水淹性
发表期刊：the Plant Journal， 2018
影响因子：5.90
实验过程
1.不定根数目是数量性状且与水淹胁迫耐受力显著相关
表型观察发现，水淹处理7天后，Zaoer-N幼苗下胚轴生长出许多不定根，而Pepino几乎没有；通过对F2群体表型统计，所有子代的不定根数目表现出正态分布，这也说明了该性状为数量性状。另外，对F2群体的949个个体进行水淹耐受力评估打分，发现不定根数目与水淹耐受力之间呈显著正相关，皮尔森相关系数为0.72（P = 0.05），这表明不定根数目可以作为衡量水淹耐受力的可靠指标。
2、ARN6.1的初定位
利用SLAF-seq的方法对亲本及两个极端混池进行测序，亲本测序深度分别为29.18×和22.85×，两个混池的深度分别为50.6×和53.72×，以9930为参考基因组，利用△SNP-index和ED的方法计算显著关联位点，将关联区域定位在6号染色体标记SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096之间，区间大小301kb（图1）。
3、ARN6.1的精细定位
利用定位区间侧翼SLAF标记（SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096）上的SNP，分别各开发KASP标记（KASP1和KASP13），并对2274个F2子代进行分析，结合基因分型和表型数据，将ARN6.1定位到61.5kb的区间（KASP10和KASP11）。为进一步缩小区间，利用KASP10和KASP11对4417个F2个体进行分型，得到6个重组个体，这6个重组个体分别自交得到6个F2:3家系，然后利用新开发的5个dCAPS对F2:3家系进行分型，结合所有表型数据，最终将ARN6.1定位在36.1kb的范围内。对该区进行注释，共有7个基因，有趣的是，其中5个基因都被预测为编码AAA 型的ATP酶家族蛋白。
2个亲本重测序分析，在36.1kb的区间内开发到25个SNP，研究者对100个黄瓜自交系的23个SNP（2个SNP只存在于Zaoer-N中而被过滤掉）进行分型，结合每个自交系不定根数目的表型数据进行局部关联分析，结果显示SNP02与表型有较强的关联性。对SNP02分析发现，其位于Csa6G504460的第二外显子，可能就是引起变异的SNP位点。
4、表达分析验证Csa6G504460
前期研究中，研究者对亲本Zaoer-N和Pepino幼苗下胚轴在水淹处理后进行转录组分析，以上定位区间内的7个基因只有Csa6G504460在处理组和对照组间存在差异表达，并且差异表达只发生在Zaoer-N中。而后，研究者对这7个基因又进行qRT-PCR分析，同样发现只有Csa6G504460在Zaoer-N的处理组和对照组间存在差异表达，并且在处理后36h表达量差异出现峰值。另外，组织特异表达分析表明Csa6G504460在多个组织中均有表达，但是在根中的表达量显著高于其他组织。因此，从基因表达角度验证了Csa6G504460（以下命名为CsARN6.1）的真实性。
5、CsARN6.1突变体降低ATP酶活性
基因组和cDNA序列分析显示，CsARN6.1拥有2个外显子，被预测为编码含有511个氨基酸残基的AAA-ATPase结构域蛋白，该蛋白中含有一个coiled-coil结构域（图2），前期关联到的SNP02即位于该结构域，由于该SNP的突变导致Asp被替换成Gly，Zaoer-N为CsARN6.1^Asp型，表现出较强的ATP酶活性，而Pepino为CsARN6.1^Gly型，几乎没有ATP活性。
6、转基因验证
为验证CsARN6.1的功能，将CsARN6.1^Asp通过PCR实验克隆后，转入拟南芥中，发现转基因植株的根长显著长于对照，同时，转基因植株上可以明显观察到侧根发育，而对照组则没有侧根发育。为进一步验证，研究者将CsARN6.1^Asp转入黄瓜品种Xintaimici（CsARN6.1^Gly型），并经多代自交和筛选，获得单拷贝的纯合转基因植株。发芽后3天，转基因植株的初生根长度显著长于野生型。水淹处理后，转基因黄瓜下胚轴中CsARN6.1的表达量显著高于野生型。处理后7天，转基因黄瓜下胚轴的不定根数目明显高于野生型。另外，野生型黄瓜叶片和子叶的萎黄病较转基因黄瓜严重。以上转基因结果证实CsARN6.1能够促进不定根形成和黄瓜水淹耐受力。
7、ATP酶活性影响黄瓜不定根形成
前期研究发现，EDTA能够抑制AAA-ATPase蛋白的ATP酶活性。研究者通过体外实验发现，经EDTA处理的CsARN6.1^Asp蛋白的ATP酶活性相对于对照降低24%（图3 a）。随后，研究者用加入EDTA的水处Zaoer-N幼苗，以检测ATP酶活性损耗对下胚轴不定根的影响。结果发现，经EDTA处理后，Zaoer-N没有了不定根生成能力（图3 b.c）。
进化树分析显示，CsARN6.1与拟南芥At2G18190和At3G50930存在较高的同源性（图3d），而在之前研究中发现，H2O2处理拟南芥后，At2G18190.1和At3G50930.1被显著诱导表达。水淹后植物体内H2O2积累是普遍的生理响应。因而研究者尝试在水中加入H2O2后处理Zaoer-N幼苗，与无水处理的对照相比，48h后处理组植株CsARN6.1的表达量是对照组的4.3倍，与不加H2O2的水处理的对照相比，48h后CsARN6.1的表达量是对照组的2.1倍（图3e）。5天后统计不同处理的材料下胚轴不定根数目，发现与不加H2O2的水处理的对照相比，水中加入H2O2的处理组的不定根数目增加60%（图3 f.g）。
总结
在该研究中，基因挖掘和功能分析使用了SLAF-seq、BSA分析、重测序、KASP、RNA-seq、qRT-PCR、PCR克隆等测序和分子实验方法 成功分离适应水淹的主效基因CsARN6.1，并验证基因功能，解析了黄瓜耐水淹分子机制。
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工具地址：
https://international.biocloud.net/zh/software/agriculture/detail/6388C5BF964943B7B4B1DDF4811A1BD2
BSA分析，即集群分离分析，它是通过具有相对性状的一对亲本杂交，在其任一分离后代群体中，根据个体表型（或基因型）的极端差异，选取一定量个体，将其DNA，RNA,SLAF-seq(百迈客自主研发的技术)混合，构建两个基因池（pool）.然后将混池测序数据与参考基因组的序列比对，基于检测到SNP,InDel等变异类型，寻找两混池间存在显著差异标记，利用欧氏距离，SNP-index等算法评估与性状关联的区域．并对区域内的基因进行功能注释和富集分析等等．在基础上还可以进行深入挖掘，如：引物设计，区域内基因挖掘及标记筛选等等！
本文系“百迈客生物”发布，转载请联系作者。