通过全基因组Bisulfite测序技术研究羊卵巢DNA甲基化与生产力之间的关系 杂志:BMC Genomics 影响因子:3.729 PMID:28969601   背景 DNA甲基化是一种表观遗传学的调控机制,在生物学调控过程中起着重要的作用,比如基因表达、基因印记、细胞分化和胚胎发生以及决定生物的表型和可塑性。甲基化发生在胞嘧啶残基的CpG核苷酸上。目前,哺乳动物中,通过高通量测序进行全基因组甲基化探索重要的生物学功能的技术被广泛应用。对农户而言,羊的生产效率以及产仔次数是重要的经济回报指标。通常情况下,生殖性状的遗传性在中等及以下,并且对表型选择的效果并不显著。因此,研究生殖能力相关的基因信息可以提高选择效率。繁殖能力由卵巢滤泡调控,该过程被精确的增殖和分化事件调控。近期的研究主要集中在DNA甲基化如何调控卵巢的形成和生殖系统发育上。一些证据表明,卵巢的发育受DNA甲基化的调控。通过对猪的卵巢甲基化分析发现,在猪的性别和卵巢发育成熟过程中存在甲基化的改变。在山羊下丘脑甲基化研究中也存在类似的结果。尽管有这些发现,但是想弄清楚DNA甲基化模式与生产力之间的关系仍然有局限。湖羊被公认为生殖系统成熟早且生产能力强,然而,最近几年的研究中,更多的注意力集中在肉质上,选择过程中关注生殖特征的研究相对较少。繁殖是一个复杂的过程,例如产仔数量这一特征受许多微效基因和一些主要基因的影响。所以了解DNA甲基化在基因功能中的作用非常必要。该研究中选用WGBS的技术对湖羊甲基化进行研究,系统的分析了DNA甲基化模式与产仔数量的潜在关系。另外,此项研究也可以增加对湖羊甲基化的认知和了解。 材料和方法 实验材料:共选取6只湖羊(Hu sheep ),年龄3岁,非妊娠母羊,分为两组: HP组(高生产力组):3只湖羊,有3次产仔记录(n=3,litter size=3) LP组(低生产力组):3只湖羊,有1次产仔记录(n=3,litter size=1) 分别将处于发情期的母羊在12小时内进行屠杀,收集身体同侧的卵巢,迅速用液氮冷冻, -80 °C储存,分别提取DNA和RNA,DNA进行bisulfite处理。 测序平台:北京百迈客生物科技有限公司 IlluminaHiSeq 2500平台,两组分别选取3个样本进行WGBS测序,两组总RNA进行转录组测序 分析平台:所有数据在百迈客云平台(BMKCloud)进行分析,分析内容如下: 1.参考基因组比对 测序片段在进行甲基化分析之前需要与参考基因组比对,通过bisulfite处理和PCR扩增将未甲基化的胞嘧啶(C)转换成胸腺嘧啶(T)。应用Bismark 软件将bisulfite处理的片段与参考基因组(Oar_v3.1)比对,其他数值均选用百迈客云平台的默认参数。用该软件进行测序深度和覆盖度的统计,以及bisulfite转化率统计,甲基化类型确定。Bismark 软件不能辨别单个胞嘧啶位点,参数设置为coverage ≥ 4×,FDR< 0.05。 2.评估甲基化水平以及鉴定DMRs 使用MOABS软件对覆盖度大于10X的胞嘧啶位点进行DMRs(差异甲基化区域)分析,运用如下公式: 3.DMGs(差异甲基化基因)生物信息分析 将DMGs与GO,COG,KEGG数据库进行比对分析这些基因的功能,进行GO富集分析,以及应用KOBAS软件对KEGG通路中显著富集的差异表达基因进行检测。并且利用String数据库对选取的DMGs进行互作网络分析。 结果 1.DNMTs表达水平 首先用qRT-PCR的方法分别对HP组和LP组卵巢中DNMTs(DNMT1, DNMT3A和 DNMT3B)表达水平进行了分析,发现HP组中DNMT1和 DNMT3A的表达水平显著低于LP组(P < 0.05)。 图1. HP组和LP组卵巢DNMTs的表达水平分析 2.DNA甲基化比对以及甲基化模式分析 HP组和LP组每个样平均产生的clean数据分别是63.59G和66.72G。比对率在71.36%-74.68%之间。平均每个组中胞嘧啶位点的甲基化率在3.5%左右。 表1.全基因甲基化测序结果 该研究中发现了3种甲基化的模式:CG,CHG(H 表示 A,C或 T), 和 CHH,这些类型在HP和LP两个组的比例是非常相似的。HP组中:89.78% CG, 2.46% CHG, 7.76% CHH;LP组中:88.60% CG,2.66% CHG,8.74% CHH。 图2.甲基化模式分析 3.甲基化序列偏好性分析 通过小提琴作图分析,图中不同的点代表不同的甲基化水平,且通过横截面积可以看出CG甲基化类型的数量较多,而CHG和CHH甲基化类型的数量较低。通过各样本染色体甲基化图谱的分析发现,染色体中大多数超甲基化胞嘧啶是CG类型的,并且不同组中染色体上的胞嘧啶甲基化位点有差异,如18号染色体。另外,研究者还分析了sequence context和甲基化偏好性之间的关系,统计了所有可能的9个碱基序列甲基化百分比,mC位点处于超甲基化状态中,CAG是CHG甲基化位点中绝大多数共同序列motif,并且两个组中CHH contexts的频率不一样。 图3.各样本甲基化分布小提琴图 4.不同功能区域DNA甲基化水平 研究者将所有的mC分为启动子、5 ’UTR、外显子、内含子、3 ’UTR这几个基因功能区域,通过这些功能区域对甲基化水平进行评估。两组中,各区域表现出相似的甲基化水平,并且CG类型的甲基化水平高于CHG和CHH类型。mC的大部分位点发生在内含子、外显子(第一个外显子除外)及下游区域。此外,在第一个外显子中CG甲基化水平低于除上游区域以外的其他部分,上游区域的甲基化水平表现出下降的趋势,TSS(转录起始位点)附近的CG位点甲基化水平低于首个外显子区域的甲基化水平。另外,在外显子和内含子中检测到高度甲基化,并且这种甲基化水平从启动子区到TSS区逐渐下降,从TSS区到内含子去逐渐增加。CHH类型是低甲基化一类并且在各功能区域较稳定,CHG类型几乎未甲基化。 图4.CGI不同功能趋势图 5.CGI区域甲基化注释 CGI(CG岛)区域功能注释发现,约68%超甲基化CGI分布在基因间区,1.5%的超甲基化CGI分布在UTR区,在两个组中没有显著差异(P > 0.05)。 图5. 不同功能部分CGI甲基化分布比例 6.HP组和LP组DMRs分析 检测两组DMRs以及根据不同的甲基化类型进行基因功能注释。共鉴定了70,899个 CG 类型DMRs, 16 个CHG类型 DMRs以及356个 CHH 类型DMRs。大多数在基因间区,5 ’ UTR 和 3 ’ UTR分别只有33和162个DMRs。基于所有的甲基化类型,除基因间区外内含子中DMRs的比例最高。研究人员还对两组DMRs进行了热图聚类分析。 图6.不同基因功能区不同甲基化模式中DMRs比例 7.测序结果验证 为了验证测序结果,从测序结果中随机选取10个DMGs进行qRT-PCR实验,结果显示HP组中GPNMB,ELK4, BACH1, CDIPT表达水平显著低于LP组,而SCYL1表达水平显著高于LP组(P < 0.05),两组中 ABCG2,mTOR,STK3, ACVR1...

题目:mRNA-miRNA整合分析揭示BR、auxin信号通路参与调控油菜分蘖(分枝)角度 发表杂志:Int J Mol Sci  影响因子:3.226 研究背景 油菜是全球范围内非常重要的一种油料作物,随着人口的增加与可用耕地面积的减少,最大限度提高包括油菜在内的各类作物的产量成为了育种学家考虑的一个重要问题。增大单位土地上的种植密度是一种增加作物产量的策略,每棵植物生长所需的地上面积主要由侧枝的数量、长度与着枝角度决定,这些因素中,对侧枝及叶子着枝角度的研究对于植物的高密度种植策略的应用具有重要的意义。 在以往的研究中已经发现,水稻中的LAZY1,、TILLER ANGLE CONTROL1、PROSTRATE GROWTH1、 LOOSE PLANT ARCHITECTURE1基因,玉米中的ZmTAC1、ZmLAZY1基因,拟南芥中的 AtLAZY1 、 AtLPA1基因均参与调控了叶子或侧枝的着枝角度。在代谢物水平,通常认为叶或枝的着枝角度与植物生长素( auxin)、油菜内脂素(Brassinosteroids,BR)的在组织中的不均匀分布有关系。 在植物中,一些microRNA也被发现与auxin调控网络或者分蘖角度相关,比如,miR393通过auxin调控网络影响叶与根的形态结构;miR164可降解转录因子NAC1转录本,从而下调植物对auxin的响应水平,抑制植物侧根的发育;auxin响应基因ARF8、ARF6在大部分物种中被miRNA167调控;水稻中,过表达miR160,水稻分蘖角度增大。 目前,油菜中对分蘖角度的研究还比较少,本研究组之前基于F2群体,使用BSA混池性状座位定位策略,鉴定到了一个与auxin合成相关,且可能参与了侧枝着枝角度调控的基因BnaYUCCA6。 该研究通过对分枝角度有显著差异的两种油菜品系进行mRNA与microRNA高通量测序,来进一步探讨油菜中与分蘖角度相关的分子调控机制。   材料与方法 材料: 油菜品系6098B(较大分枝角度,约52度) 油菜品系Purler(较小分支角度,约22度) 方法: 测序类型:mRNA、microRNA高通量测序 测序平台:illumina Hiseq 2000测序平台 取样方法:两个品系的均取抽薹时期与花发育早期两个时间点的分枝发生部位。每个品系每个时期1个样本(每个个体至少取5个分枝发生部位,最多6个个体混样样本),总共4个样本,每个样本分别进行mRNA测序与microRNA测序 数据分析平台:百迈云数据分析平台(http://www.biocloud.net/) Figure 1 技术路线 结果:mRNA测序与分析 a)每个样本测序得到~6Gbase 可用数据,与参考基因组比对率~80%。 b)差异表达基因筛选(EBseq,FDR < 0.05 & |FC|>2):如图2A所示,抽薹期,两个品系间检测得到5908个差异表达基因;花发育早期,两个品系间检测到5397个差异表达基因。其中3261个为两个时间点共有差异表达基因。 c)对上述3261个共有差异表达基因进行GO功能分析,如图2B所示,差异基因在biological adhesion、biological phase、and locomotion、 macromolecular complex、cell junction、and nucleoid 、nuclear and protein binding transcription factor activity and receptor activity等GO term上有显著富集。 d)对两个时间点所有差异基因进行KEGG通路分析,其中3297个基因注释到了KEGG数据库 ,其中大多数基因注释到了 ribosome 、oxidative phosphorylation相关代谢通路。值得注意的是,在两个时间点分别有58、51个差异基因注释到了植物激素信号通路,进一步分析发现,这些通路大多为BR或auxin信号转导通路。该部分结果如图3所示。 Figure...

Biochemical and Comparative Transcriptomic Analyses Identify Candidate Genes Related to Variegation Formation in Paeonia rockii PMID: 28817092 杂志:Molecules 影响因子:2.861 研究背景:牡丹是木本灌木,芍药属牡丹组,是一种重要的传统观赏植物,花瓣大而有吸引力。在十个牡丹野生种中P. rockii(紫斑牡丹)白色花瓣的基部有明显的黑色彩斑,而P. ostii(凤丹)没有花瓣杂色。花的颜色是牡丹的一个重要的商业特性,花瓣颜色的多样性可提高牡丹的观赏价值,因此阐明P. rockii中紫斑的形成机制具有重要意义。众所周知,牡丹的基因很大组(13–16 GB),往往具有较高的杂合度和配子体自交不亲和性,在缺少完整的基因组序列的情况下,RNA测序技术是获得基因组表达信息最有效的工具。到目前为止,几个花青素生物合成相关基因在牡丹中已确定,但是色斑形成的分子机制还不清楚。 材料方法: 取P. rockii (PR),P. ostii (PO)和PR与PO的杂交F1代(RO),分别收集4月底到五月初5个不同开放阶段的三种牡丹的花瓣进行转录组分析,三个生物学重复。取阶段5(完全开放期)的花瓣进行形态解剖分析和色素含量分析。 技术路线: 实验结果: 花瓣颜色测量,形态解剖分析和色素含量分析 为了确定色斑性状的遗传背景,利用PO和PR杂交产生F1植株(RO),所有60株F1植株在花瓣的基部都有色斑存在(Figure 1),PR的彩斑呈显性遗传。根据英国皇家园艺学会比色卡(RHSCC),在阶段5的PR和RO的背景与PO花瓣一样为白色,而在第5阶段的PR和RO的色斑颜色有差异。PR色斑为深紫色,而RO的为紫红色。 Figure 1. Fully open flowers of individuals selected for sequencing. 为了阐明其色斑形成的机制,作者检测了色素在PR, PO和RO花瓣中的空间位置。在非色斑花瓣中没有色素细胞(Figure 2C,I,L)。相反,色素细胞主要位于色斑花瓣的上、下表皮和栅栏组织中(Figure 2F,O)。色素细胞在PR的杂色相应也位于表皮内(正面),这可能有助于PR色斑更深的颜色(图左)。在非杂色花瓣中,表皮细胞是无色的(图2A,B,G - K)。 Figure 2. Cellular features of the flower materials. HPLC分析表明,在P. rockii和F1代牡丹花瓣的色素中含有四种花青素(CY3G5G,CY3G,芍药色素(Pn)3G5G和Pn3G)。PR的色斑显示出“Cy > Pn”的表型,CY3G是含量最高的花青素(28.36 ±...

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小RNA和降解组联合测序揭示microRNA调节茶叶(Camellia sinensis)中儿茶素生物合成 Combined small RNA and degradome sequencing reveals complex microRNA regulation of catechin biosynthesis in tea (Camellia sinensis)   杂志:PLOS ONE 影响因子:2.806 PMID: 28225779   研究背景 MicroRNAs是一种内源性非编码小RNA,在动植物转录后调控及其他生物学过程中有至关重要的作用。基于碱基互补配对机制,miRNAs主要通过直接切割目标mRNA和抑制目标基因转录这两种方式调节目标基因的表达。前期研究表明,miRNA参与多种植物的生长和发育过程,如:根、叶、花的形态发生,信号转导,激素反应和营养代谢等。植物miRNAs主要通过克隆、生物信息预测、高通量测序和Northern 杂交的方法来检测。最常用的技术是高通量测序,不仅经济实惠,而且在低丰度的情况下可以更简单、快速获得大量miRNAs。植物中miRNA主要是通过切割目标基因或者抑制目标基因的表达进行调控,所以目标基因的确定对miRNA功能的分析至关重要。miRNAs目标基因的预测可以通过生物信息的方法,目标基因的鉴定主要通过降解组测序和5’-RLM-RACE方法(RNA连接酶介导的5'cDNA末端的快速扩增),这两种方式还能鉴定miRNA目标基因切割位点,有助于miRNA功能分析。 茶树(Camellia sinensis),富含儿茶素,是风靡全球的非酒精饮料之一。儿茶素是茶叶中重要的组成部分,包括脂型儿茶素(如:ECG和EGCG)和非脂型儿茶素(如:EC和EGC)。EGCG是茶叶中含量最丰富的儿茶素并且具有较强的抗癌效果,可以制约癌细胞的生长,抑制雄激素受体的功能并调控癌细胞的生存,血管的生成和移动。基于他们的分子构成,儿茶素可以分为简单儿茶素和脂型儿茶素。在儿茶素的合成过程中有许多酶的参与,如查耳酮合酶(CHS),查尔酮异构酶(CHI),黄烷酮醇4-还原酶(DFR),花青素合酶(ANS),花青素还原酶(ANR)和类黄酮3,5羟基化酶(F3’5’H)。MiRNA被鉴定为转录和转录后水平基因表达的重要调节因子,并且裂解目标mRNA是植物中基因表达的主要调控方式。 在茶树中,虽然通过高通量测序和芯片技术发现了许多保守的以及新的miRNAs,但是miRNAs直接调控儿茶素生物合成还没有明确的定义。此项研究中,研究人员通过高通量测序鉴定茶叶中保守的以及新的miRNAs,再通过5’-RLM-RACE方法分析潜在的目标miRNAs。通过表达模式分析进一步筛选儿茶素积累过程中潜在的miRNAs。结合5’-RLM-RACE实验和表达模式分析,研究人员发现了一些新的调节儿茶素生物合成途径中基因切割的调控因子。 材料和方法 实验材料 茶树1005,取叶片(包括芽,第一叶,第二叶,第三叶,第四叶,第五叶,成熟叶),进行混合,提取总RNA。 茶树1005,取叶片(包括第一叶,第三叶,成熟叶),进行qRT-PCR表达分析和儿茶素含量测定。 测序平台:Illumina HiSeq 2500 (Biomarker Technology Co.) 技术路线 实验结果 1.茶叶中miRNA的初步分析 从提取的总RNA中构建smallRNA文库,测序质控后得到19,567,691条clean reads,与数据库比对发现有18.83%的rRNA,1.23%的tRNA,0.01%的small nuclear RNA,0.07%的重复序列,其中79.85%的序列没有功能注释,可以将这些没有功能注释的序列用来做下一步的miRNA的预测和鉴定。根据smallRNA的测序长度分布图可以得出,miRNA的长的主要分布在20-25nt之间,丰度最高的是24nt(47.89%)。这个长度分布和其他栽培茶以及其他植物报道的结果非常相似。 2.茶叶中保守miRNAs的鉴定 将没有功能注释的clean reads与miRBase(植物已知保守miRNA数据库)进行比对,共获得69个保守的miRNAs,分别属于62个家族。根据长度分布发现,这些保守的miRNAs的长度主要集中在18-25nt之间,长度主要集中在24nt(46.385),其次是21nt。 对高通量测序的miRNA片段进行分析,鉴定的保守miRNA中,read values低于1000的占91.3%的比例,其中read values低于10的占56.52%的比例。研究人员还发现了一些高表达(read values大于1000)的miRNA家族,如miR165a和miR396a。另外,在不同家族中的miRNAs表达量差异较大,并且在同一家族中各miRNAs之间的表达量也有较大差异。这些数据表明,不同家族miRNA的表达模式不同,意味着不同的miRNAs在茶树生长发育过程中的作用不一样。 3.茶叶中新miRNAs的鉴定 通过miRDeep2和Mfold软件分析,共鉴定出47个新的miRNAs,进一步对这些新miRNA进行片段长度和表达量分析。新miRNA跟保守miRNA长度分布相似,主要集中在18-25nt之间,最集中的长度是24nt和21nt。另外,新miRNA的表达量比保守miRNA的低,新miRNA中表达量最高的只有4517个read values。   研究人员将这些新的miRNA与其他植物中已知的miRNA进行比对,揭示了许多同系物。除了三个miRNA归为同一个家族外,绝大多数的miRNA可以被分为独立的家族。研究者还对新miRNA的前体进行了分析,发现他们都有一个发卡环结构,长度在84-114bp。 4.GO功能富集和KEGG通路分析目标miRNA 为了研究茶树miRNA的功能,研究人员运用TargetFinder软件和转录序列对上述miRNA进行目标基因预测。结果显示,其中97个miRNA对644个目标基因有调控作用。再将644个目标基因进行GO和KEGG通路富集分析:GO富集分析发现这些目标基因主要富集在细胞、细胞器、细胞膜、连接活性、转运活性、新陈代谢和细胞进程等功能条目;KEGG通路富集发现366个目标基因参与36个代谢网络相关,主要参与糖酵解、柠檬酸循环、氨基酸代谢、光合作用、脂肪酸代谢、嘌呤嘧啶代谢、氧化磷酸化、植物病原体相互作用、初级代谢产物和次级代谢产物过程。 miRNA靶向基因降解组测序和功能分析 为了进一步预测和鉴定miRNA靶向基因,研究团队构建了降解组文库并进行深度测序,结合转录组数据和上述获得的miRNAs,通过TargetFinder软件预测到216个靶向基因被97个miRNAs调控。在这些靶向基因中,降解组测序鉴定了26个基因的26个切割位点,被16个miRNA家族的19个miRNAs进行转录后调控,如表1。 表1.通过降解组测序鉴定茶树1005中miRNA靶向基因 基于5’-RLM-RACE技术对目标断裂位点的验证 研究人员采用5’-RLM-RACE的方法,对其中5个有注释的miRNA(来自降解组测序)切割位点进行验证。结果显示,目标基因comp152929被csn-miR396a1 和 csn-miR396a2共同调控,切割位点在目标基因的第11-12个核苷酸处;两个基因comp159882和comp157894同时被miRNA167a调控,且有共同的切割位点,在目标基因的第11-12个核苷酸处;另外,miRNA394a调控comp156493,切割位点有两处,分别为第10-11,17-18个核苷酸处;同样的,novel-miR2调控comp145093,切割位点也有两处,分别为第10-11,12-13个核苷酸处。5’-RLM-RACE的实验验证了这些降解组分析的结果,另外一些切割位点有待进一步的验证。 7.茶叶中miRNA的表达模式分析 对茶树1005叶片儿茶素含量的研究发现,儿茶素在不同叶片中的的含量由高到低排序为:第一叶,芽,第二叶,第三叶,成熟叶。第一叶,第三叶和成熟叶的儿茶素含量有显著差异。 为了探索茶叶中miRNAs与儿茶素合成相关性,研究人员采用qRT-PCR的方法分析第一叶、第三叶以及成熟叶中miRNA(read values高于平均值)表达。通过表达模式的成簇分析将这些miRNA分成三组。第一组,miRNA表达模式与儿茶素含量成正相关,分别有novel-miR10, novel-miR13, novel-miR19, csn-miR165a, csn-miR170, csn-miR2593e 和novel-miR12;第二组,miRNA表达模式与儿茶素含量成负相关,分别有novel-miR1, novel-miR2, csn-miR160a, csn-miR162a, csn-miR394 和csn-miR396a;第三组,miRNA表达模式与儿茶素含量没有显著相关性,有csn-miR4380a。 8.调控儿茶素生物合成基因miRNA的鉴定 为了深入了解miRNA在调控儿茶素合成代谢中的功能,研究人员将高通量测序获得的miRNA跟NCBI数据库以及RNA测序的儿茶素生物合成相关基因的mRNA进行BLAST,预测可能的miRNA。为了消除假阳性,对预测的断裂位点进行实验验证。通过5’-RLM-RACE实验验证了6个可能参与儿茶素生物合成功能基因表达调控的miRNA。它们分别是csn-miRNA167a、f...

分子生物学的中心法则中,遗传信息从DNA传递给RNA再流向蛋白质,此过程中RNA不仅发挥遗传信息传递的作用,还负责调控各种生物学过程。早在40年前研究者就发现mRNA存在类似于基因组DNA和组蛋白上可逆的表观遗传修饰(其中N6-methyladenosine m6A是最常见的一种转录后修饰,介导了超过80%的RNA碱基甲基化),但当时并不清楚RNA这种修饰的具体功能,随着近期研究的深入逐渐揭开了mRNA甲基化的神秘面纱,它可以参与调控基因表达,并进一步调节细胞的分化和发育。对mRNA甲基化相关的转录组测序数据的分析当然离不开便捷、可靠的数据深度挖掘工具啦!近期百迈客云平台Blast小工具助力孙青原老师关于m6A参与调节爪蟾卵母细胞减数分裂成熟和胚胎发育的文章发表于“Journal of biological chemistry”杂志。接下来,小编跟大家分享这篇文章。 N6-methyladenosine seqencing highlights the involvement of mRNA methylation in oocyte meiotic maturation and embryo development by regulating translation in Xenopus laevis N6-甲基腺苷测序揭示mRNA甲基化通过调节非洲爪蟾的翻译水平参与卵母细胞减数分裂成熟和胚胎发育 PMID: 27613873 杂志:Journal of biological chemistry (JBC) 影响因子:4.12 研究背景在动物(如爪蟾、小鼠)的卵子发生过程中,生殖泡(GV)期卵母细胞达到最大体积,同时基因组转录活动被沉默。成熟的GV期卵母细胞重新开始分裂、发育到第二次减数分裂中期(MII期)后卵母细胞与精子结合形成受精卵,受精卵开始分裂起始胚胎发育,直到中囊胚期全基因组转录活性恢复。因此,卵母细胞生长过程中积累的母源mRNAs的翻译应得到精确的调控。近期的研究证据揭示修饰(m6A)参与调解mRNA翻译,且m6A修饰在mRNA的不同区域会产生不同的翻译修饰效应。目前,m6A修饰是否参与非洲爪蟾卵母细胞翻译调控,及其在卵母细胞成熟和胚胎发育中的扮演的角色还不清楚。 材料方法1.实验材料: GV期和MII期爪蟾卵母细胞。 2.测序方法: 提取GV期和MII期爪蟾卵母细胞总RNA后分别进行m6A-seq测序。 技术路线实验结果1. GV期和MII期爪蟾卵母细胞的m6A-seq对GV期和MII期爪蟾卵母细胞的m6A修饰mRNAs进行分离和测序分析后与X. laevis转录组比对,鉴定了4207条甲基化修饰的mRNAs(GV期4128条;MII期3820条)。根据m6A峰的高度,作者把这些mRNAs分为三类:高m6A mRNAs、中m6A mRNAs和低m6A mRNAs。通过这些结果发现从GV期到MII期有1674个mRNAs保持甲基化修饰水平,此外有2400条mRNAs的m6A水平下降、133条mRNAs的m6A水平升高(Figure 1A)。 利用m6A峰值对应序列,作者预测了爪蟾中保守的m6A基序。与人和小鼠中相似,爪蟾中mRNA甲基化也发生在GGACU基序(Figure 1B)。研究还发现m6A峰主要分布在编码DNA序列(CDS)的下游位置的CDS末端位点附近(Figure 1C)。  Figure 1. Summary of the m6A modified mRNAs...

植物抗旱研究的老师看过来了,近期华中农业大学水稻研究团队成功构建水稻双基因转化抗旱株,并借助百迈客云计算平台(www.biocloud.net)挖掘该抗旱株转录组测序数据,完成对该新型水稻抗旱株抗旱机制初步探究。 中文题目:OsbZIP46、SAPK6基因共同过表达提升水稻抗旱能力 IF = 4.298                  PMID:28694815   研究背景干旱是全世界范围内威胁水稻产量的主要非生物胁迫之一。作物的抗旱性状一般认为由多基因控制,因此,抗旱相关多基因转化策略理论上可以作为提高水稻抗旱性的一种有效手段。 脱落酸(abscisic acid,ABA)信号通路在植物非生物胁迫响应网络中处于中心位置,该通路包含4个主要组件:a)ABA 受体PYR/PYL/PCAR,b)A型蛋白磷酸酶2C,c)蛋白激酶SnPK2,d)bZIP转录因子家族(第3亚家族)。之前研究表明,bZIP转录因子活性在多种植物中可被蛋白磷酸酶SnPK2s通过磷酸化调节。我们之前的研究也表明,bZIP转录因子OsbZIP23和OsbZIP46在水稻抗旱过程中扮演着重要角色,且其转录调控活性可被SnPKs家族SAPK2与SAPK6激活。因此,bZIP转录因子家族与SAPKS蛋白磷酸酶家族可作为多基因转化策略中的候选基因来提升水稻抗旱能力。 技术路线 材料与方法材料 转化基因:OsbZIP46CA1(bZIP转录因子OsbZIP46删除负调控domainD)+ SAPK6(蛋白磷酸酶家族); 转化载体:pCB2004质粒 水稻转化受体材料 : 东北种植品质KY131 水稻转基因材料:XL22(OsbZIP46CA1+SAPK6),CA1-OE(OsbZIP46CA1),SAPK6-OE(SAPK6) RNA-seq材料:XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N4叶龄种子材料,每个处理3个生物学重复 方法 转化:农杆菌介导转化 插入片段拷贝数检测:Southern Blot 插入基因转录水平评估:荧光定量PCR 插入基因蛋白表达及活性评估:荧光定量PCR检测OsbZIP46CA1调控基因Rab21、 Rab16B在转基因材料中的转录水平;转基因材料对ABA敏感性判断转化基因是否正常过蛋白过表达且产生活性 抗旱性评估: 种子发育期,缺水处理7天,恢复给水7天后存活率;生殖生长期,孕穗期缺水处理14天,产量、灌浆速率、穗数、小穗花数等指标 RNA-seq测序:Hiseq测序平台,百迈客云(www.biocloud.net)数据分析平台 结果1、转化株构建与筛选 1)使用MISSA系统构建pCB2004+OsbZIP46CA1+SAPK6重组质粒,采用农杆菌介导转化方法将两个抗旱相关目标基因插入东北栽培品种水稻KY131基因中,构建OsbZIP46CA1、APK6双基因转化株。另外,也使用同样的转化体系分别构建了上述两个基因的单基因转化株。 2)通过southern-blot杂交技术,鉴定T0初始转化株中插入基因的拷贝数,挑选插入基因单拷贝的T0的T1子代初步鉴定具备抗旱性状的转基因株(肉眼观察)。 3)最终筛选得到一个在生殖器官发育阶段抗旱强于非转基因株的双基因转化株XL22,见图1B。 4)利用荧光定量PCR技术,检查了XL22转基因株及其对应的单基因转化株中的插入基因是否过表达,如图1C所示,上述转化株中插入基因均出现了预期的转录水平。 5)以OsbZIP46CA1的下游调控基因Rab21、Rab16B的转录水平,转化株对ABA的敏感性来判断插入基因是否发挥作用,如图1C所示,转化株中点的Rab21、 Rab16B转录水平均出现上调,且转化株对ABA更加敏感,说明上述转化株中的插入基因均能正常发挥作用。 2、XL22转化株抗旱能力评估 a)生殖生长期抗旱能力评估:XL22、CA1-OE(OsbZIP46CA1转化株)、SAPK6-OE(SAPK6转化株)、KY-131-N(非转基因株)4组材料,每组4个独立生物学重复,孕穗期缺水处理14天,比较不同材料之间的单株产量、灌浆速率、穗数、小穗花数、圆锥花序数、单位面积产量6个指标。如图3所示,无论是肉眼观察(3A、3B)结果,还是上述6个指标(3C)统计结果,都表明XL22在抗旱性上要优于单基因转化株与非转基因株。 b)种子发育期抗旱能力评估:XL22、CA1-OE(OsbZIP46CA1转化株)、SAPK6-OE(SAPK6转化株)3组材料(4叶龄),每组3个生物学重复,7天缺水处理,观察恢复给水7天后的叶片卷曲情况,统计存活率。如图4A所所示,恢复给水7天后,XL22相较于单基因转化株,叶卷曲更加轻微,如图B所示,XL22的存活率也要显著高于单基因转化株。另外,如图4所示,XL22离体叶片子在室内环境下,脱水速度也显著低于其他材料。该结果表明,XL22在种子发育阶段的抗旱能力也要强于单基因转化株。 3、XL22转化株耐热、抗寒能力评估 分别取XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N的4叶龄种子材料,每个3个生物学重复,均进行42℃ 12小时,4℃5天处理,最后正常环境下生长7天,观察这各材料之间的叶卷曲清苦以及存活率,结果显示,XL22表现为个更高的存活率(图5C),更加轻微的叶片卷曲(图4A),表明XL22相较于单基因转化株与非转基因株拥有更强的耐热、抗寒能力。 4、RNA-seq揭示XL22抗旱分子学机制 a)为了分析XL22抗旱表型后的基因调控网络,研究者分别对XL22、 CA1-OE、SAPK6-OE 3个转化株系在正常给水与相同缺水处理条件下的材料进行了转录组测序,取样部位为倒二叶,每个处理设置两个生物重复,测序使用illumina Hiseq平台,PE150读取方式,数据分析在百迈客云计算平台(www.biocloud.net)完成。 b)分析结果显示,XL22的缺水处理相较于正常给水组材料,2977个基因转录水平显著上调,3243个显著下调;CA1-OE中,2962个基因转录上调, 3514个基因转录下调;SAPK6-OE中,3433个基因转录上调,3472个基因转录下调(FDR < 0.01, |FC| > 2)。大部分的转录上调基因在3个材料之间是共有的,如图6B所示,表明这些上调基因在水稻干旱胁迫响应中功能比较保守。 c)由于转基因材料中过表达基因为bZIP家族转录因子及其活性激活基因家族,研究者重点关注了3个材料中转录上调的基因,这些基因被划分为4类:Group1,XL22相较于CA1-OE特有上调基因,645个;Group2,XL22相较于SAPK6-OE特有上调基因,500个基因特异上调;Group3,CA1-OE相较于SAPK6-OE特有上调基因,398个;Group4,SAPK6-OE相较于CA1-OE特有上调基因,869个。Group I主要分布在“Response to ABA”、“Regulation of Plant-type Hypersensitive response”等GO term;Group II主要分布在“Organic Substance Biosynthetic Process” 、“Salicylic Acid...

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