09月01 【成功案例】百迈客云全面解析水稻抗旱分子机制
植物抗旱研究的老师看过来了，近期华中农业大学水稻研究团队成功构建水稻双基因转化抗旱株，并借助百迈客云计算平台（www.biocloud.net）挖掘该抗旱株转录组测序数据，完成对该新型水稻抗旱株抗旱机制初步探究。
中文题目：OsbZIP46、SAPK6基因共同过表达提升水稻抗旱能力
IF = 4.298 PMID:28694815
干旱是全世界范围内威胁水稻产量的主要非生物胁迫之一。作物的抗旱性状一般认为由多基因控制，因此，抗旱相关多基因转化策略理论上可以作为提高水稻抗旱性的一种有效手段。
脱落酸（abscisic acid,ABA）信号通路在植物非生物胁迫响应网络中处于中心位置，该通路包含4个主要组件：a）ABA 受体PYR/PYL/PCAR，b）A型蛋白磷酸酶2C，c）蛋白激酶SnPK2，d）bZIP转录因子家族（第3亚家族）。之前研究表明，bZIP转录因子活性在多种植物中可被蛋白磷酸酶SnPK2s通过磷酸化调节。我们之前的研究也表明，bZIP转录因子OsbZIP23和OsbZIP46在水稻抗旱过程中扮演着重要角色，且其转录调控活性可被SnPKs家族SAPK2与SAPK6激活。因此，bZIP转录因子家族与SAPKS蛋白磷酸酶家族可作为多基因转化策略中的候选基因来提升水稻抗旱能力。
技术路线
材料
转化基因：OsbZIP46CA1（bZIP转录因子OsbZIP46删除负调控domainD）+ SAPK6（蛋白磷酸酶家族）；
转化载体：pCB2004质粒
水稻转化受体材料 ： 东北种植品质KY131
水稻转基因材料：XL22（OsbZIP46CA1+SAPK6），CA1-OE（OsbZIP46CA1），SAPK6-OE（SAPK6）
RNA-seq材料：XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N4叶龄种子材料，每个处理3个生物学重复
方法
转化：农杆菌介导转化
插入片段拷贝数检测：Southern Blot
插入基因转录水平评估：荧光定量PCR
插入基因蛋白表达及活性评估：荧光定量PCR检测OsbZIP46CA1调控基因Rab21、 Rab16B在转基因材料中的转录水平；转基因材料对ABA敏感性判断转化基因是否正常过蛋白过表达且产生活性
抗旱性评估： 种子发育期，缺水处理7天，恢复给水7天后存活率；生殖生长期，孕穗期缺水处理14天，产量、灌浆速率、穗数、小穗花数等指标
RNA-seq测序：Hiseq测序平台，百迈客云（www.biocloud.net）数据分析平台
1、转化株构建与筛选
1）使用MISSA系统构建pCB2004+OsbZIP46CA1+SAPK6重组质粒，采用农杆菌介导转化方法将两个抗旱相关目标基因插入东北栽培品种水稻KY131基因中，构建OsbZIP46CA1、APK6双基因转化株。另外，也使用同样的转化体系分别构建了上述两个基因的单基因转化株。
2）通过southern-blot杂交技术，鉴定T0初始转化株中插入基因的拷贝数，挑选插入基因单拷贝的T0的T1子代初步鉴定具备抗旱性状的转基因株（肉眼观察）。
3）最终筛选得到一个在生殖器官发育阶段抗旱强于非转基因株的双基因转化株XL22，见图1B。
4）利用荧光定量PCR技术，检查了XL22转基因株及其对应的单基因转化株中的插入基因是否过表达，如图1C所示，上述转化株中插入基因均出现了预期的转录水平。
5）以OsbZIP46CA1的下游调控基因Rab21、Rab16B的转录水平，转化株对ABA的敏感性来判断插入基因是否发挥作用，如图1C所示，转化株中点的Rab21、 Rab16B转录水平均出现上调，且转化株对ABA更加敏感，说明上述转化株中的插入基因均能正常发挥作用。
2、XL22转化株抗旱能力评估
a）生殖生长期抗旱能力评估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1转化株）、SAPK6-OE（SAPK6转化株）、KY-131-N（非转基因株）4组材料，每组4个独立生物学重复，孕穗期缺水处理14天，比较不同材料之间的单株产量、灌浆速率、穗数、小穗花数、圆锥花序数、单位面积产量6个指标。如图3所示，无论是肉眼观察（3A、3B）结果，还是上述6个指标（3C）统计结果，都表明XL22在抗旱性上要优于单基因转化株与非转基因株。
b）种子发育期抗旱能力评估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1转化株）、SAPK6-OE（SAPK6转化株）3组材料（4叶龄），每组3个生物学重复，7天缺水处理，观察恢复给水7天后的叶片卷曲情况，统计存活率。如图4A所所示，恢复给水7天后，XL22相较于单基因转化株，叶卷曲更加轻微，如图B所示，XL22的存活率也要显著高于单基因转化株。另外，如图4所示，XL22离体叶片子在室内环境下，脱水速度也显著低于其他材料。该结果表明，XL22在种子发育阶段的抗旱能力也要强于单基因转化株。
3、XL22转化株耐热、抗寒能力评估
分别取XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N的4叶龄种子材料，每个3个生物学重复，均进行42℃ 12小时，4℃5天处理，最后正常环境下生长7天，观察这各材料之间的叶卷曲清苦以及存活率，结果显示，XL22表现为个更高的存活率（图5C)，更加轻微的叶片卷曲（图4A），表明XL22相较于单基因转化株与非转基因株拥有更强的耐热、抗寒能力。
4、RNA-seq揭示XL22抗旱分子学机制
a）为了分析XL22抗旱表型后的基因调控网络，研究者分别对XL22、 CA1-OE、SAPK6-OE 3个转化株系在正常给水与相同缺水处理条件下的材料进行了转录组测序，取样部位为倒二叶，每个处理设置两个生物重复，测序使用illumina Hiseq平台，PE150读取方式，数据分析在百迈客云计算平台（www.biocloud.net）完成。
b）分析结果显示，XL22的缺水处理相较于正常给水组材料，2977个基因转录水平显著上调，3243个显著下调；CA1-OE中，2962个基因转录上调， 3514个基因转录下调；SAPK6-OE中，3433个基因转录上调，3472个基因转录下调（FDR < 0.01, |FC| > 2）。大部分的转录上调基因在3个材料之间是共有的，如图6B所示，表明这些上调基因在水稻干旱胁迫响应中功能比较保守。
c）由于转基因材料中过表达基因为bZIP家族转录因子及其活性激活基因家族，研究者重点关注了3个材料中转录上调的基因，这些基因被划分为4类：Group1，XL22相较于CA1-OE特有上调基因，645个；Group2,XL22相较于SAPK6-OE特有上调基因，500个基因特异上调；Group3，CA1-OE相较于SAPK6-OE特有上调基因，398个；Group4，SAPK6-OE相较于CA1-OE特有上调基因，869个。Group I主要分布在“Response to ABA”、“Regulation of Plant-type Hypersensitive response”等GO term；Group II主要分布在“Organic Substance Biosynthetic Process” 、“Salicylic Acid Biosynthetic Process” 、“Regulation of Hydrogen Peroxide Metabolic Process”等GO term；Group3主要分布在“Gene Expression and Regulation”、 “Nitrate Related Metabolic Process” 、 “Carbohydrate Biosynthetic Process” 等GO term；Group4主要分布在 “Cytokinesis and Cell Proliferation”、“Microtubule Related Process”、“Response to Abiotic Stress” 等GOterm（见图6C）。因此推测，XL22中的两个基因可能激活了不同的干旱胁迫应答基因。
d）为了揭示GroupI 、Group2两个基因集内部的基因调控关系，研究者基于STRING数据库分别绘制了上述两个基因集内部基因的蛋白互作网络图。如图7所示，GroupI蛋白互作网络中包含481个PPI（protein-protein intereaction，PPI），Group2中包含280个PPI。其中，有6个基因在蛋白互作网络中均处于非常中心的位置（与之互作蛋白数量越多，越靠近中心位置）。其中，3个（LOC_Os12g13720, LOC_Os03g58800, LOC_Os09g31486) 在两个蛋白互作网络中均处于中心位置，分别编码 PDR ABC transporter, a ATPase, and a DnaK/Hsp70s family protein,可能在干旱应答过调控网络发挥着非常关键的；其他3个基因（Group1特异：LOC_Os04g42260 LOC_Os02g38580，Group2特异：LOC_Os05g03050）分别编码protein phosphatase、Rad51、Hsp90 ，从功能可以看出，它们与水稻干旱应答同样相关。
- 构建了抗旱OsbZIP46CA1+SAPK6双基因转化水稻XL22。
- 揭示了XL22抗旱表型后部分分子调控机制，为之后进一步的分析调控机制研究提供参考信息。
研究中涉及到的转录组数据分析，从下机数据质控、与参考基因组比对，到基因转录水平定量、差异表达分析，到最后共表达分析、蛋白互作分析，均是该实验室的同学们在百迈客云平台的有参转录组APP提供的图形化界面下自主完成的，该步操作无需编程语言基础，无需linux系统命令行界面下软件安装、调试与运行经验，更重好的是无需等待，基础分析7天完成，个性化分析几分钟人机交互完成1次，你要做的只是网页下简单几步便可完成数据导入、参数设定、任务运行、结果查看、数据后期挖掘等数据分析步骤。