09月01 【成功案例】云平台助力爪蟾卵母细胞m6A修饰mRNA功能研究
分子生物学的中心法则中，遗传信息从DNA传递给RNA再流向蛋白质，此过程中RNA不仅发挥遗传信息传递的作用，还负责调控各种生物学过程。早在40年前研究者就发现mRNA存在类似于基因组DNA和组蛋白上可逆的表观遗传修饰（其中N6-methyladenosine m6A是最常见的一种转录后修饰，介导了超过80%的RNA碱基甲基化），但当时并不清楚RNA这种修饰的具体功能，随着近期研究的深入逐渐揭开了mRNA甲基化的神秘面纱，它可以参与调控基因表达，并进一步调节细胞的分化和发育。对mRNA甲基化相关的转录组测序数据的分析当然离不开便捷、可靠的数据深度挖掘工具啦！近期百迈客云平台Blast小工具助力孙青原老师关于m6A参与调节爪蟾卵母细胞减数分裂成熟和胚胎发育的文章发表于“Journal of biological chemistry”杂志。接下来，小编跟大家分享这篇文章。
N6-methyladenosine seqencing highlights the involvement of mRNA methylation in oocyte meiotic maturation and embryo development by regulating translation in Xenopus laevis
N6-甲基腺苷测序揭示mRNA甲基化通过调节非洲爪蟾的翻译水平参与卵母细胞减数分裂成熟和胚胎发育
PMID: 27613873
杂志：Journal of biological chemistry (JBC)
影响因子：4.12
在动物（如爪蟾、小鼠）的卵子发生过程中，生殖泡（GV）期卵母细胞达到最大体积，同时基因组转录活动被沉默。成熟的GV期卵母细胞重新开始分裂、发育到第二次减数分裂中期（MII期）后卵母细胞与精子结合形成受精卵，受精卵开始分裂起始胚胎发育，直到中囊胚期全基因组转录活性恢复。因此，卵母细胞生长过程中积累的母源mRNAs的翻译应得到精确的调控。近期的研究证据揭示修饰（m6A）参与调解mRNA翻译，且m6A修饰在mRNA的不同区域会产生不同的翻译修饰效应。目前，m6A修饰是否参与非洲爪蟾卵母细胞翻译调控，及其在卵母细胞成熟和胚胎发育中的扮演的角色还不清楚。
1.实验材料：
GV期和MII期爪蟾卵母细胞。
2.测序方法：
提取GV期和MII期爪蟾卵母细胞总RNA后分别进行m6A-seq测序。
对GV期和MII期爪蟾卵母细胞的m6A修饰mRNAs进行分离和测序分析后与X. laevis转录组比对，鉴定了4207条甲基化修饰的mRNAs（GV期4128条；MII期3820条）。根据m6A峰的高度，作者把这些mRNAs分为三类：高m6A mRNAs、中m6A mRNAs和低m6A mRNAs。通过这些结果发现从GV期到MII期有1674个mRNAs保持甲基化修饰水平，此外有2400条mRNAs的m6A水平下降、133条mRNAs的m6A水平升高(Figure 1A)。
利用m6A峰值对应序列，作者预测了爪蟾中保守的m6A基序。与人和小鼠中相似，爪蟾中mRNA甲基化也发生在GGACU基序(Figure 1B)。研究还发现m6A峰主要分布在编码DNA序列（CDS）的下游位置的CDS末端位点附近(Figure 1C)。
为了研究RNA甲基化是否参与卵母细胞成熟和胚胎发育，作者利用DAVID工具对m6A修饰mRNA进行了KEGG通路分析。结果高或者中等甲基化的mRNAs主要富集在ErbB、孕激素介导的卵母细胞成熟和细胞周期等通路中。但是，低甲基化的mRNAs主要被富集在RNA降解、DNA复制、核糖体、剪接体、磷酸戊糖途径和糖酵解途径相关通路中。
为了进一步评估这些m6A修饰在非洲爪蟾卵母细胞的生物学功能，作者利用biocloud平台的BLAST工具对爪蟾mRNAs进行了注释(www.biocloud.net)。GO注释的结果显示，卵母细胞m6A甲基化mRNAs主要与生物学过程有关，如：转录、蛋白磷酸化和细胞分裂。
为了探索mRNAs甲基化是否与翻译有关，作者把mRNA甲基化数据与Smits等人已发表的转录组和蛋白组数据进行了整合。通过BLAST分析，在RNA/蛋白数据中找到了723个m6A修饰mRNAs的信息。GV期或者MII期卵母细胞中高m6A峰的RNA水平（log10 RNA RPKM值）比总RNA高（在卵或者胚胎中），但是蛋白水平（log10 protein amount / fmol）比总蛋白水平低（Figure 2）。与高度甲基化的mRNAs相比，低甲基化RNAs显示出非常高的表达水平（Figure 3）。这些结果说明在卵母细胞或早期胚胎中，m6A修饰可能与mRNA翻译有关。
