07月03 “逆向思维”——良性病变组织NGS研究高分文章解析
习惯了正向思维不如来个反向思维；
恶性癌组织研究多了不如研究下良性病变组织
文献：Ye L, Zhou X, Huang F, et al. The genetic landscape of benign thyroid nodules revealed by whole exome and transcriptome sequencing[J]. Nature Communications, 2017, 8.
研究背景：
乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）：是最常见的甲状腺癌，其发病率约占甲状腺癌发病率的70-80%， 每10万人中有5.7个人患有PTC，女性约为8.8人，男性约为2.7人，属于低度恶性肿瘤，分化程度高，预后良好。甲状腺癌发病的第一症状是在颈部的甲状腺区出现结节，结节常为无痛性，甲状腺结节发生率很高，这些结节中约有5%的结节可能会出现癌变。已经有诸如TCGA等研究机构对PTC的肿瘤相关变异进行了鉴定（BRAF和RAS基因突变等），但是对于良性结节的基因组特征所知甚少。良性增生性甲状腺结节，尤其是腺瘤样结节，尚未研究过。
新颖点/研究目的：1.甲状腺癌组织研究的很多，良性结节的遗传和表达景观如何？
- 传统认为PTC和良性结节具有独立起源，是否可以提供基因组层面证据？
- 传统的基因检测技术通过检测恶性癌组织相关突变标志提供纳入标准（rule-in）辅助诊断，是否可以鉴定良性组织相关突变标志提供排除标准（rule-out）？
实验材料：共计28例患者的经过手术获得的127个样本的癌组织（PTC）或结节组织、正常组织及配对的germline外周血液样本。患者根据有无PTC癌组织分成2组，TB和SB（只有良性结节，且持续2年）。
研究结果：
1.良性腺瘤样甲状腺结节相比于乳头状甲状腺癌具有独特的变异
外显子组测序（平均161X）结果显示，相比于外周血，在正常组织、良性结节组织和乳头状甲状腺癌组织中共计检测到了528个基因中的688个体细胞突变，肿瘤组织和结节组织中体细胞突变数目（/Mb）明显高于正常组织，但肿瘤组织和结节组织的突变特征（6种类型的碱基替换及其上下文）却明显不同。
经过高频突变基因（significantly mutated genes,SMGs）分析，乳头状甲状腺癌中以BRAF突变为主（80%样本中携带），最主要的是BRAFV600E突变，这与TCGA的研究是一致的。而良性结节（TB和SB两组）组织中与癌组织中完全不同，检测到了互相排斥的ZNF148 (21.4%)、SPOP (14.3%) 和EZH1 (10.7%)。
高频突变基因频谱
在额外的231例良性结节中对上述三个基因中主要的体细胞突变进行了验证，ZNF148基因突变频率有所下降（5.4%），其他2个基因突变保持相似水平（SPOP P94R 11.2%，EZH1 Q571R 9.3%）。55例滤泡状甲状腺癌（follicular thyroid carcinomas，FTC）中未检测到上述3个基因突变，表明特异存在于良性结节中。
SPOP，EZH1和ZNF148体细胞突变示意图
利用人正常甲状腺细胞系Nthy，构建突变体进行功能实验发现，EZH1 Q571R突变细胞系相比于野生型细胞系，细胞增殖能力轻微增加，侵袭能力降低。EZH1体细胞突变可能是甲状腺肿的早期刺激因素之一。
细胞增殖和侵袭实验
对外显子数据进行CNV分析，只在癌组织中检测到了已知的PTC相关的22号染色体长臂arm水平拷贝数缺失，而良性结节中没有发现重现性的CNV。转录组数据分析后，也没有发现重现性或者功能性的基因融合。
TB组来自相同PTC患者配对的癌组织和良性结节间相同的突变很少
PTC癌组织-良性结节pairs间的共有突变频率展示
PTC癌组织和良性结节的重叠突变频率最低（0-21.4％，中位数7.7％）。 当考虑匹配的正常组织时，只有9个PTC癌组织和良性结节对显示重叠的突变（1.7-7.4％）。共有突变少与纯度没有显著相关性。TB组20个PTC患者的配对组织间体细胞突变变异等位基因频率（variant allele frequency,VAF）进行相关性分析，癌组织-良性结节间的相关性最差。
配对样本间体细胞突变VAF相关性热图
良性结节与PTC癌组织间具有不同的基因表达模式
对9个患者（5个TB和4个SB）的26个组织进行转录组测序，相比于正常甲状腺组织共计检测到21441个差异表达基因，只有8％的上调和3.1％的下调基因在PTC和良性结节之间重叠。
差异表达基因Venn图
经过层次聚类分析，恶性癌组织聚类在一起，和良性结节/正常组织分开，且TB和SB的良性结节组织聚类在一起，表明二者间相似的功能。
差异表达基因层次聚类热图
采用3种已知的甲状腺分化和信号传导特征分类器均发现良性结节和PTC癌组织明显分离。3个分类器分别为：甲状腺分化评分（TDS，16个与甲状腺代谢和功能相关的基因）、ERK活性评分（EAS，用于MEK / ERK活性测定的52个基因）和BRAF-RAS突变特征相关的71个基因集。
甲状腺分化评分TDS和ERK活性评分热图
良性结节和PTC癌组织独立进化
对20名患者构建了系统发育树，以说明PTCs、良性结节和正常甲状腺组织之间的进化关系。大多数患者（15/20例）在良性结节和PTC之间早期即处于不同分支进化，特别是在正常甲状腺组织纳入分析时，表明PTC癌组织与良性结节间早期分离和不同的进化模式。
基于突变的系统发育树
研究结论
本研究提供强有力的证据表明良性甲状腺结节具有与PTC癌组织不同的遗传和转录组景观，证实了良性结节发育与PTC肿瘤形成不同。 良性甲状腺结节不同于癌前病变，例如存在复发性BRAF突变的黑素细胞痣或具有恶性转化风险的良性病变。作者认为，将SPOP，ZNF148和EZH1作为良性结节相关基因的纳入，通过提供“排除”信息，有可能提高基于DNA的突变检测的诊断效能。在目前的甲状腺分子诊断中添加良性相关突变标志，从而提供“排除”信息，可能会增加其诊断功效。
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