07月19 【成功案例】鸡中腹部前脂肪细胞分化过程中lncRNA和mRNA表达的全基因组分析
Genome-Wide Analysis of lncRNA and mRNA Expression During Differentiation of Abdominal Preadipocytes in the Chicken
PMID: 28108554
杂志：G3 (Bethesda)
影响因子：2.861
研究背景：腹部脂肪是肉鸡的重要胴体性状。选育过程中对鸡快速生长率的过分强调导致了过多的脂肪堆积，过量的脂肪沉积导致饲料转化率、胴体产量、产蛋率、受精率和孵化率降低。因此，腹部脂肪含量较低成为肉鸡的主要育种目标。脂肪细胞生成是受多种转录事件调节的一个复杂过程，近期的一些研究通过全基因组范围内的mRNA (Ji et al. 2012；Regassa and Kim 2015)和microRNA (Wang et al. 2015)分析，探索了鸡脂肪生成的相关调节机制。但是目前对脂肪生成的调节机制知之甚少。此外，长链非编码RNA（lncRNA）调节脂肪形成和其他与代谢组织发育和功能相关的过程，但是鸡体内前脂肪细胞分化期间lncRNAs的功能和特征尚不清楚。
材料方法：
1.实验材料：
取14日龄京海黄鸡，无菌条件下分离4g腹部脂肪组织。剪碎组织、胶原酶I消化并分离基质血管组分后，利用DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清），在35℃和5% CO2的条件下培养至90%汇合度。分别诱导分化0、48、96和144 小时后取样进行RNA-seq，每个时间点做三个生物学重复。
2.测序方法及数据量：
RNA-seq，Illumina XTen. 从12个样本总共获得了1,300,074,528 clean reads (195.02 Gb)。
技术路线：
实验结果：
- 测序结果和质量控制
分离培养腹部前脂肪细胞，诱导分化48小时、96小时和144个小时后取样进行RNA-seq，未诱导分化的细胞（0小时）作为对照。对12个样本的文库进行测序得到1,300,074,582 (195.02 Gb) clean reads。每个样本的Q30都在92.81%以上，平均GC含量为52.51%，12个样本的比对率在79.40和84.30%之间。
- 前脂肪细胞lncRNA及其功能预测
经筛选获得了27,023个新的lncRNA。基于lncRNA顺式作用功能鉴定了4915个靶基因。进一步通过GO分析发现总共有1746、1544和2174个基因分别被富集到生物过程、细胞组成和分子功能三个GO条目内。KEGG富集分析显示917个基因被显著富集到包括Wnt、MAPK和血管平滑肌收缩通路中。
- 腹部前脂肪细胞分化相关的差异表达lncRNAs和mRNAs分析及功能注释
将分化0、2、4、6天的前脂肪细胞样本进行两两比较(A0 vs. A2；A0 vs. A4；A0 vs. A6；A2 vs. A4；A2 vs. A6和A4 vs. A6)得到了1,336个差异表达lncRNA和1,759个差异表达mRNA，在各个阶段差异表达的基因(Differential expression, DEGs)的数量随着细胞分化而下降(Figure 4)。3095个DEGs的GO分析结果显示生物过程分类的前三个富集条目是细胞代谢过程、细胞过程和电子传递链。在分子功能分类中前三个富集条目是转移酶活性、蛋白结合和核苷结合。在细胞组分类别中前三个富集条目是细胞质部分、细胞质和胞外区。通路分析结果显示丙酸代谢、脂肪酸代谢，内质网蛋白质加工和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解途径被显著富集。此外，通过k-means均值聚类，3,095个差异基因被聚成8个表达模式。其中，K2这一簇基因中在前脂肪细胞分化中起着重要作用。
Figure 4 Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs) at different stages.
- 共表达网络和模块构建
对3095个DEGs的共表达网络分析鉴定出10个关联模块（figure 6B）。随后对这些模块进行了基于特征向量基因的聚类分析，10个模块被分为四组：第一是蓝绿色模块；第二：红色，棕色，粉红色的模块；第三模块，包括紫色和红色；第四组为蓝色，黑色，绿色，黄色的模块（figure 6C）。属于同一组的模块可能具有相同或相似的功能和调节机制。
Figure 6 Visualization of construction of the coexpression network.
- 时期特异性模块的鉴定和可视化
使用加权基因共表达网络分析（WGCNA），鉴定了与A0（第0天），A2（第2天）和A6（第6天）阶段相关的6个阶段特异性模块，这些模块的表达模式可能在脂肪细胞分化中发挥重要作用（figure 6B, D）。
- 核心和高度相关基因的鉴定
在黑色、蓝色、绿色和黄色四个高度相关的模块中鉴定了五个共同的基因。这表明xloc_068731，xloc_022661，染色质解旋酶DNA结合蛋白6（CHD6），幼虫巨大致死基因同源物1（llgl1），以及Neuralized E3泛素蛋白连接酶1b（neurl1b）可能在A2分化阶段扮演重要的角色。在棕色模块，Kelch家族成员38（klhl38）和xloc_045161为高度相关的mRNA与lncRNA，表明其潜在的脂肪细胞分化调控作用在A6阶段。肌动蛋白相关蛋白6同源物（actr6）和xloc_070302是A0时期与分化调节相关的重要调节因子（Figure 8）。
Figure 8 Visualization of connections of genes in various modules.
- 阶段特异性模块基因的GO和通路分析
GO分析显示，RNA代谢过程、调节定位、及细胞代谢过程均在A0期富集；前体代谢物质和能量产生，电子传递链，有机物氧化的能量产生在A2阶段高度富集；囊胚发育和细胞过程均在A6阶段富集。在通路分析中， A0和A6阶段没有鉴定出显著的通路。A0阶段的前三个通路是卵母细胞减数分裂，溶酶体，和半乳糖代谢；而不饱和脂肪酸合成，细胞凋亡，和丙酸代谢是A6阶段的前三个通路。A2阶段氧化磷酸化被显著富集。
- RT-PCR验证差异表达基因
选取用于RNA-seq的样本中的核心和高度相关基因XLOC_045161, XLOC_070302, XLOC_068731, XLOC_022661,ACTR6, CHD6, LLGL1和NEURL1B进行RT-PCR验证，实验结果与RNA-Seq结果一致（Figure 9）。
Figure 9 Validation of highly connected genes using RT-qPCR. *P ＜0.05, **P＜0.01.
结论：经RNA-seq和筛选在鸡前脂肪细胞中获得了27,023个新的lncRNA。不同分化阶段的前脂肪细胞两两比较总计鉴定出3095个DEGs，它们参与甘油脂代谢、mTOR、PPAR和MAPK信号通路。通过RT-PCR鉴定和验证了8个阶段特异性模块中的高度相关基因，实验结果与RNA-Seq结果一致。
创新点：
这项研究第一次分析了鸡腹部脂肪前体细胞分化过程中lncRNA和mRNA的表达。首次报道了一些与前脂肪细胞分化相关的通路，包括丙酸代谢，脂肪酸代谢和氧化磷酸化途径，为进一步研究鸡的lncRNA提供了宝贵的资源，有利于更好的了解鸡的前脂肪细胞分化。