07月19 【成功案例】通过转录组分析合浦珠母贝同种异体移植血细胞中免疫相关差异表达基因的鉴定
Differentially expressed immune-related genes in hemocytes of the pearl oyster Pinctada fucata against allograft identified by transcriptome analysis
杂志：Fish & Shellfish Immunology
影响因子：3.148
PMID: 28126621
研究背景：合浦珠母贝是在中国普遍养殖的海洋珍珠贝，占海洋珍珠产业90%以上的比例。为了培养珍珠，需要将供体珍珠牡蛎的地幔片用细胞核移植到受体中，但是移植后的免疫抑制反应会使成功率降低。加强了解宿主牡蛎对移植体的免疫反应有利于提高珍珠培养技术的效率。然而，当前的研究中关于珍珠贝对同种异体移植的免疫抑制报道却很少。本文拟通过对移植的合浦珠母血细胞转录组动态变化进行研究，获得移植反应过程相关基因。
研究材料：
生长1.5年的健康合浦珠母贝（P. fucata）
将和浦珠母贝进行同种地幔片移植手术，分别收集手术后0h和48h血淋巴，每个时期选取6-7只牡蛎的样本进行混合，分别提取两个样本的total RNA。
研究方法：在本研究中，对同种异体移植后0小时和48小时的珍珠贝的血细胞免疫反应进行了转录组分析。与合浦珠母贝的参考基因组进行了比对，为了鉴定所有与免疫相关的差异表达基因，本研究进行了GO注释和KEGG通路分析。最后，随机筛选免疫相关差异表达基因进行qRT-PCR验证，以确保研究的准确性。
测序平台：Illumina Hiseq 2500 platform
测序数据量：测序得到92.5M的clean reads
技术路线：
结果
结果
1.测序结果
两个样本Raw reads经过去接头和去低质量的reads后分别得到6.1Gb（0h）和6.2Gb（48h）的数据量。且每个样本的Q30值都大于92%，GC含量分别是44.73%（0h）和42.19%（48h），与合浦珠母贝参考基因组比对率分别是58.95%（0h）和60.27%（48h），如表1所示。
表1.转录组测序数据统计分析
2.基因注释结果
与合浦珠母贝参考基因组比对，共获得1912个新基因，通过与NR/Swiss-Prot/ GO/ COG和KEGG数据库比对，其中1579个基因找到注释信息，另外333个基因没有在数据库中找到注释信息，如表2所示
表2.新基因注释信息统计
3.两组之间差异表达分析结果
比对0h和48h基因表达量，共获得798个差异表达基因（其中410个上调基因，388个下调基因）。在这些差异表达基因中其中有226个与编码热休克蛋白家族的基因在0h高表达，其中314个与编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和EF-hand 钙离子结合蛋白的相关基因在48h高表达，这些基因都与免疫防护有关。
图1.0h/48h每个基因表达水平火上图
4.差异表达基因功能注释结果
为了进一步研究这些差异表达基因的生物学价值，对这798个差异表达基因按照功能进行GO富集分析，共产生45个GO terms。所有的基因都归到cellular component（17个terms），molecular function（11个terms）和biological processes（17个terms）三个功能类别，其中与免疫相关的差异表达基因主要富集在“biological process”一类，且这一类别中有9个差异表达基因富集在免疫系统过程子分类，有67个差异表达基因富集在刺激反应子分类。
图2.差异表达基因GO分类
5.免疫反应相关差异表达基因的鉴定结果
为了在这些差异表达基因中更进一步的挖掘免疫相关基因，研究人员将免疫反应相关差异表达基因按照不同功能进行分类，获得64个GO terms，其中包含51个差异表达基因，有刺激反应（8个基因）、抗菌体液反应（5个基因）、对压力的响应（8个基因）。其他的GO terms主要与这些子分类相关：受体介导的胞吞、真菌反应、饥饿反应以及损伤修复。鉴定了一些参与细胞凋亡和死亡的基因，包含金属蛋白酶-19基质、丝氨酸/苏氨酸激酶、Kr-h1、酪氨酸蛋白激酶Abl、和ATP结合转运蛋白。另外，有24个差异表达基因属于刺激、压力和温性反应的GO类别。这些基因跟移植免疫反应相关（其中6个上调，18个下调），包括TLR 和HSP。
研究人员将以上获得的所有的差异表达基因比对到KEGG数据库去寻找与免疫反应相关的基因。在798个差异表达基因中，有122个基因对应到64个KEGG通路。其中，19个免疫相关基因对应到16个通路，包括内吞作用（5个）、NOD-like受体信号通路（1个）、泛素介导蛋白质水解（4个）和其他路径。研究人员主要关注抵御病原体入侵相关的toll-like受体信号通路和溶酶体。这一路径有四个主要的基因家族，分别有TLRs、 IRFs、Ils和 TNFs。共鉴定了1个与TLR信号通路相关的unigene，2个与溶酶体相关的unigene 。
图3.Unigene的KEGG通路分布图
该研究通过基因注释、聚类分析和通路分析的方法，最终鉴定了72个典型的免疫基因（其中25个上调基因，47个下调基因）。随后，研究人员将这些免疫相关差异表达基因按照不同时期进行分层聚类分析，在0h和48h两个时期的免疫相关差异表达基因有明显不同，说明移植前后牡蛎中免疫相关变化明显。
图4. 分层聚类分析
6.qRT-PCR验证
研究者随机对其中18个免疫相关的差异表达基因进行qRT-PCR实验。结果显示用qRT-PCR检测到的倍性变化与RNA-Seq的表达模式相比，结果基本一致，且RNA-Seq检测更敏感。
图4.qRT-PCR验证
研究结论
该转录组研究共发现了1912个新基因，移植和非移植组比对后共有798个差异表达基因，通过GO富集和KEGG通路分析等方式最终鉴定出了72个典型的免疫相关基因，包括TLRs、细胞因子、HSPs、细胞凋亡和抗氧化剂等。另外，通过qRT-PCR对其中18个免疫相关的差异表达基因进行验证，实验结果与RNA-Seq的结果基本一致表明该实验结果准确可信。
创新点
首次通过合浦珠母贝转录组测序研究寻找到与同种异体移植免疫相关的基因，为进一步分析合浦珠母贝同种异体移植的免疫抑制提供了依据，为同种异体移植牡蛎存活率的提高提供了有价值的信息。