ranscriptome Analysis of Floral Buds Deciphered an Irregular Course of Meiosis in Polyploid Brassica rapa
云平台助力芜菁花芽转录组比较分析解析多倍体异常减数分裂过程
杂志： Frontiers in Plant Science
影响因子：4.298
PMID:28553302
云平台助力郑州大学的老师们发表了一篇关于四倍体与二倍体芜菁转录组比较分析的文章，这是第一个同时在细胞和转录组水平证明染色体多倍性对减数分裂过程有不利影响的研究，有助于全面了解二倍体和多倍体芜菁减数分裂时花芽转录组的一致性和差异性。
研究背景：
多倍体化对于动植物进化及物种形成具有重要意义。染色体倍性增加在大多数植物中十分常见，约30-80％的被子植物在进化过程中历经这一过程，种内基因组复制可产生同源多倍体，种间杂交可产生异源多倍体。理解多倍体对植物繁殖的影响对于多倍体育种项目具有重要意义。
本文在细胞和分子水平对同源四倍体、二倍体芜菁的生殖组织（未成熟的花芽）进行了转录组比较分析。先进行细胞学分析，发现结果显著异常后，进行RNA测序分析，进一步阐明这种细胞学差异的分子机制。
材料和方法:
材料：温室中培育芜菁同源四倍体和二倍体，采集1-1.5mm的花芽。
细胞学分析：花芽制片观察染色体行为。
转录组分析：二倍体花芽样本T1，T2，T3,同源四倍体样本T4，T5，T6进行测序，筛选DEGs，进行功能注释及相关验证。
测序平台：Illumina HiSeq 2000
分析平台：BMKCloud，具体分析如下：
测序原始数据去接头、低质量序列后与参考基因组比对（TopHat2），对比对上的序列进行转录本重构，评估表达水平（Cufflinks）。鉴定DEGs（logFC≥2，FDR<0.01）并与Nr、UniProtKB\Swissprot、KOG、COG、GO、KEGG等数据库进行比对注释。
研究结果：
1.同源四倍体芜菁异常的减数分裂过程
减数分裂过程中染色体行为分析结果显示：二倍体中，同源染色体中期配对为二倍体，后期分离（图1A-D）。四倍体中，在减数分裂中期I形成多倍体和单倍体，在后期I、II发生不均等分离（图1E-L）。
图1 四倍体芜菁异常染色体行为
统计结果表明与二倍体相比，芜菁多倍体化后整个减数分裂过程发生了不规则变化。
图2 四倍体芜菁减数分裂中异常染色体行为分析
2.测序结果
每个样本文库得到29.07 GB clean read，Q30≥88.55% 。同源四倍体、二倍体比对到参考基因组效率分别为74.34%，75.88%。样本组的表达模式分析共得到40927个基因，其中有1001个新基因。
3.DEGs分析
40927个基因中，4601个基因是差异表达的（图3A），2343个上调，2259个下调（图3B），两组间DEGs占比较少（(11.24%）。随机挑选DEGs进行层次聚类，分析表达模式（图3C），发现四倍体中K1、K3、K6、K9类别下调，K2、K4、K5、K7，K8类别显著上调。
图3 DEGs表达分析
与COG、GO、KOG、Nr、KEGG、Swiss-Prot比对后，97%的DEGs至少能与一个数据库比对上（表1）
表1 差异表达Unigene注释
COG分类中，2615个DEGs可归到25个COG类别（图4），其中包含最多DEGs的类别为：复制重组与修复（222个,8.49%），转录（261个,9.98%），一般功能（515个,19.69%)，与KEGG结果一致。
GO分类中大多数DEGs聚类到细胞过程（61.97％），繁殖过程（15.49％），结合过程（42.96％）（图5）。
KEGG功能注释结果表明，4,601个DEGs中有1,453个可归到50个生物途径。高度富集的通路为：氨基酸合成（48个，3.3％），植物激素信号转导（61个，4.2％）和蛋白质加工内质网途径（47个，3.2％）（图6）。
图4 COG分类
图5 新DEGs的GO分类
图6 KEGG富集通路
4.减数分裂相关DEGs分析
为阐述四倍体芜菁减数分裂过程改变相关的遗传信息，选择以下明显与减数分裂相关的COG类别进行细分：（1）复制，重组和修复;（2）染色质结构和动力学;（3）细胞周期控制，细胞分裂，染色体分区;（4）细胞骨架。在4,601个位点中，共鉴定出288个与减数分裂相关的基因（图7A）。
应用拟南芥数据库（TAIR）的BLASTN搜索，进一步鉴定芜菁中减数分裂直系同源基因，11个两组间差异表达的已知减数分裂基因。如图7所示，显著富集的L组（复制，重组和修复）包含121个上调、102个下调基因，这组聚类结果（图8B）显示已知减数分裂基因（包括RAD54，DMC1和RPA）在四倍体芜菁中表达显著下调。D组（细胞周期控制，细胞分裂和染色体分配）中，10个下调，13个上调，已知的减数分裂基因DIF1/SYN1和CyclinA1-2/TAM上调（图7C）。在B组（染色质结构和动态变化）（图7D），有7个基因上调，包括已知调节开花时间和植物发育的NF-YB8基因，14个基因下调，包括组蛋白相关基因（H2AV和H4）。Z组（细胞骨架）中，8个基因上调，7个基因下调（图7E），且没有已知减数分裂相关基因。已知减数分裂基因MMD1和HOP2在一般功能组（R）中富集（图4）。HOP2，XRI1，ZYP1a和ZYP1b未归到任何COG组。
KEGG比对后将288个中的108个DEGs分配到28个途径，包括减数分裂相关同源重组（2.8％），DNA修复和重组（6.5％），DNA复制（3.7％），染色体和相关蛋白（4.6％）。
图7 COG分类中减数分裂相关基因分布及表达分析
同源重组对于真核生物减数分裂中SPO11蛋白质引起的DSBs的精确修复十分重要，作为调节关键介质的DMC1，RAD54和RPA在这个途径中显著下调。Cyclin-A1-2 / TAM是DNA复制途径中唯一与细胞周期蛋白有关的基因，表达上调。这些结果表明染色体集在同源四倍体中增加了一倍，与减数分裂有关的大多数基因可能通过上调或至少正常表达以满足减数分裂期间基因组含量增加的需求。否则，减数分裂关键基因下调可能会干扰四倍体减数分裂中染色体行为。
qRT-PCR 对24个减数分裂相关基因进行验证，20多个基因表达与测序结果一致。对拟南芥中直系同源基因分析结果显示两个物种减数分裂相关基因的总体表达模式相近。
结果：
本研究细胞学分析发现，合成多倍体整体减数分裂过程是显著不规则的。为从分子水平阐明这一过程的遗传基础，本文进行了同源四倍体和二倍体芜菁花芽间的遗传调节差异的转录组比较分析。在40927个表达基因中，同源四倍体芜菁花芽中鉴定出4601个DEGs，其中288个与减数分裂相关。DMC1（已知减数分裂特异性基因，与DSBs同源染色体依赖性修复相关）在同源四倍体芜菁中表达显著下调，可能与减数分裂I期的异常有关。某些RNA解旋酶，细胞周期、体细胞DNA修复相关的DEG在基因组复制后表达上调，减数分裂DSB修复有关基因表达显著下调。芜菁和拟南芥中减数分裂相关基因的总体表达模式相近。
创新点：
这是第一个在细胞和转录组水平证明染色体多倍性对减数分裂过程有不利影响的研究，有助于全面了解二倍体和多倍体芜菁减数分裂时花芽转录组的一致性和差异性。
参考文献：Braynen J, Yang Y, Wei F, et al. Transcriptome Analysis of Floral Buds Deciphered an Irregular Course of Meiosis in Polyploid Brassica rapa[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8:768....
